Últimas Notícias - Terapia Gênica

PITTSBURGH,USA – Pesquisadores da Universidade de Pittsburgh,  conseguiram introduzir em um vetor viral a parte mais importante do gene da distrofina (que é muito grande); neste trabalho os pesquisadores conseguiram identificar a menor quantidade do gene da distrofina que mantém a sua capacidade funcional. Quando inoculado em músculos de camundongos incapazes de produzir distrofina, o “mini-gene” foi capaz de produzir distrofina, em quase 90% dos músculos tratados. (a pesquisa foi publicada em “Proceedings of the National Academy of Sciences”).  A página pessoal do Dr. Xiao Xiao, pesquisador principal deste trabalho é http://www.pitt.edu/~rsup/mgb/xiaoxiao.html  

São Paulo – notícia publicada no caderno ciências da Folha de São Paulo de 11/02/2001 mostra alguns detalhes sobre a pesquisa a ser realizada no Centro de Terapia gênica de Ribeirão Preto e a possibilidade de correção da doença por células tronco retiradas do cordão umbelical de irmãos sadios.

USA - Pesquisa financiada pela MDA-USA  desenvolve em laboratório uma espécie de camundongo geneticamente modificada, capaz de produzir mIgf1 (muscular insulin like growth factor 1). Esta proteína é  normalmente produzida por jovens, músculos sadios e estimula o crescimento muscular e a regeneração. Níveis elevados de mIgf1 durante toda a vida capacitam as células musculares se recuperar de agressões que normalmente causariam danos permanentes. Como na distrofia muscular a idade se acompanha de perda muscular e prejuízo na capacidade de recuperação dos músculos lesados. Especula-se sobre a possibilidade de uso desta proteína em camundongos com distrofia.

http://www.nature.com/cgi-taf/dynapage.taf?file=/ng/journal/v27/n2/index.html

http://www.mdausa.org/news/010130supermice.html

Trangene, uma empresa francesa, detentora de uma patente americana e européia para transferência de genes, iniciou pesquisas clínicas com transferência de genes; nove indivíduos com distrofia muscular de Duchenne ou Becker foram injetados com plasmídeos contento o vírus da distrofina; eles serão acompanhados para observar as reações de imunogenicidade destas aplicação antes que novas aplicações sejam realizadas.

 http://www.muscular-dystrophy.org/start/Dickson%20pr-3.html

http://www.transgene.fr/us/comp0013.htm

http://www.pharmalicensing.com/news/adisp/971387828_39e633b439ba7

USA - X. Xiao é um pesquisador de Pittsburgh que desenvolveu um  minigene da distrofina, com tamanho suficiente pequeno para ser colocado em um vetor viral e ser utilizado em terapia génica. Em outras pesquisas ele já tinha demonstrado que este minigene era eficiente. Nesta pesquisa ele injetou o vírus em um músculo de camundongos adultos com distrofia muscular experimental. Os resultados demonstraram que houve um aumento significativo da função muscular nos camundongos que receberam este tratamento. As pesquisas deste grupo são muito promissoras mas seguem em um ritmo extremamente lento. 

USA - as células tronco da medula óssea poderiam ser utilizadas no tratamento da distrofia muscular; no entanto esta modalidade de tratamento até o momento só foi utilizada em animais.  Os pesquisadores Louis M. Kunkel, identificador  da proteína distrofina e Kenneth Weinberg relataram no Journal of Clinical Investigation desta semana o caso de  um paciente que  foi submetido a um transplante de medula sem que se soubesse que era portador de distrofia muscular; ou seja, descrevem um raro caso de um experimento natural (por acaso). O menino que nasceu com uma imunodeficiência recebeu com um ano de idade um transplante de medula óssea. Quando ele estava com 12 anos foi diagnosticada uma segunda doença genética: a distrofia muscular. No estudo de suas células musculares foi observado que cerca de 1% das células do doador estavam incorporadas aos músculos e contendo o gene produtor da distrofina. Este menino apresenta uma forma pouco severa da doença o que não pode ser atribuido ao transplante de medula óssea visto que uma pequena quantidade de células do doador foram encontradas em seus músculos. Não está provado que estas células estão produzindo distrofina. Este estudo contrasta com outro trabalho publicado esta semana na revista Science pelos Dr. Irving Weissman e colaboradores da Stanford University; neste trabalho os pesquisadores evidenciaram que as células tronco da médula óssea só produzem células sanguíneas e não são incorporadas a outros órgãos.  

USA - Uma das preocupações com a terapia gênica é a maneira como o organismo irá reagir ao vírus que levará o gene até a célula e a reação à proteina que irá ser produzida pelo gene.Esta resposta pode prejudicar o resultado do tratamento. Neste trabalho os pesquisadores estudaram a resposta imunológica em camundongos portadores de distrofia muscular que receberam um adenovirus que continha o gene da distrofina e da beta galactosidase. A injeção do vírus diretamente no músculo resultou na expressão estável da distrofina por 5 meses em camundongos recém-nascidos e por 4 semanas em camundongos adultos. Os autores encontraram anticorpos contra o vírus nos camundongos adultos mas não nos recém-nascidos. No entanto anticorpos contra a distrofina tanto em camundongos recém-nascidos como nos adultos. Este resultado indica que quando for possível a terapia gênica haverá necessidade de um tratamento complementar (drogas imunossupresoras semelhante as que os transplantados recebem) para impedir que após o tratamento ocorra reação imunológica que prejudicaria o resultado do tratamento.

USA - em artigo a ser publicado online esta semana (ainda não disponível hoje) na revista "Proceedings of the National Academy of Sciences" o pesquisador Jeffrey S. Chamberlain, professor de Neurologia da Escola Medica da  Universidade de Washington, obteve ótimos resultados em camundongos com distrofia muscular tratados com injeção intramuscular de um vetor viral com o gene integral da distrofina. Os camundongos tratados apresentaram aumento da força muscular em 40% superior aos que não foram tratados. Outra boa notícia é que os resultados foram equivalentes em camundongos jovens e adultos, indicando que este tratamento será possível também em quem já apresenta  os sintomas da doença. Alguns nós ainda precisam ser desatados: a) qual será a resposta do sistema imunológico a injeção deste vírus?; b) qual será o resultado quando a injeção do vírus for realizada por via endovenosa?

Esta notícia ganhou um grande destaque no mundo hoje:

http://www.msnbc.com/news/808862.asp?0si=-#BODY

http://news.bbc.co.uk/2/hi/health/2262217.stm

http://www.cbsnews.com/stories/2002/08/15/tech/main518846.shtml

http://www.health-news.co.uk/showstory.asp?id=97108

http://www.tribnet.com/news/local/story/1793435p-1909016c.html

http://www.modbee.com/24hour/healthscience/story/538581p-4259208c.html

http://www.gainesvillesun.com/apps/pbcs.dll/article?Site=GS&Date=20020917&Category=NEWS02&ArtNo=209170328&Ref=AR&Profile=1001

http://www.wcax.com/Global/story.asp?S=937526&nav=4QcS4R25BHZI

http://www.zwire.com/site/news.cfm?newsid=5391292&BRD=1281&PAG=461&dept_id=7574&rfi=6

 

França - Transgene, uma empresa francesa de biotecnologia, e que está realizando pesquisas avançadas com terapia gênica obteve ontem nos Estados Unidos 10 novas patentes para suas pesquisas avançadas com vetores virais e não virais para tratamento de diversas doenças. No comunicado a imprensa a empresa se autodenomina como a primeira que possui um vetor não viral com o gene da distrofina para tratamento da distrofia muscular de Duchenne. No site da Trangene há informações de que "diversas" pesquisas estão em andamento para avaliar as possibilidades de tratamento com vetores virais e não virais da distrofia muscular. Em se confiando nestas informações a empresa é a que está investindo mais e em diferentes linhas de pesquisa no tratamento das distrofias musculares.

USA - a utilização de vírus para levar os genes até as células é a técnica mais pesquisada mas ainda não se conseguiu sucesso total; alguns nós destas pesquisas estão nos artigos anteriores deste mês;cientistas da Universidade de Stanford desenvolveram uma nova técnica de terapia gênica que permite levar mais facilmente os genes até as células, sem usar vetores virais; por esta técnica o gene seria levado por bacteriófagos e se incorporaria nestas células enquanto elas estivessem vivas. Eles testaram esta técnica em laboratório utilizando a pele de quatro pacientes com epidermólise bolhosa distrófica (doença de pele). Os resultados foram positivos em todas as amostras demonstrando a possibilidade de utilização desta técnica para levar genes grandes como o da distrofia muscular e o da fibrose cística.

O resumo integral do artigo saiu na revista Nature Medicine (Stable nonviral genetic correction of inherited human skin disease Susana Ortiz-Urda, Bhaskar Thyagarajan, Douglas R. Keene, Qun Lin, Min Fang, Michele P. Calos & Paul A. Khavari - Published online: 16 September 2002, doi:10.1038/nm766)
 

USA - A repercussão da divulgação do artigo acima trouxe aos pais uma grande expectativa pela possibilidade de tratamento da distrofia muscular através da utilização de células tronco da medula óssea; o artigo também criou uma pressão adicional á Associação Americana da Distrofia Muscular (MDA-USA) por causa da demora em se iniciar as pesquisas clínicas. Para esclarecer os pais a MDA divulgou uma nota (transcrita integralmente abaixo) esclarecendo que o uso de células tronco da medula até o momento mostrou baixos resultados e que os pesquisadores identificaram várias dificuldades que impedem no momento a realização de estudos clínicos em seres humanos; a nota afirma também  que esforços estão sendo feitos para apressar estes estudos sobre a utilização de células tronco.

"September 13, 2002

TO: Families of Those Affected by Duchenne and Becker Muscular Dystrophy

FROM:     Robert Ross
                President & CEO
                Muscular Dystrophy Association

RE: Application of Stem Cell Therapy in Treating Neuromuscular Diseases

Stem cell research is an emerging area of scientific investigation which holds extraordinary promise for advancing the development of therapies for the muscular dystrophies and other neuromuscular disorders. Media coverage of reports on the use of stem cells has been extensive . A September 10, 2002 article in The New York Times (copy attached) summarizes one such report. The following is offered to help place this and similar reports in a realistic context.

The Times article indicates that MDA Scientific Advisory Committee Member Louis M. Kunkel, Ph.D. and his team have verified the presence of donor cells in the skeletal muscle of a young man with Duchenne muscular dystrophy who had earlier received a bone marrow transplant (a source of stem cells) for an immune deficiency disease. Although it's significant that some donor cells were found in his muscle tissue, the efficiency of the procedure was very low.

While researchers are optimistic that stem cell therapy will be used to effectively treat neuromuscular disorders, the low efficiency of stem cell incorporation into muscle at this point means that the therapeutic application of stem cell technology is still a number of years in the future.

The Association has taken steps to accelerate stem cell research by sponsoring meetings of specialists to review and evaluate progress, and has established a stem cell working group to guide the Association's efforts in this area. At its most recent meeting the group focused on identifying a series of critical milestones that must be met in order to conduct a bone marrow transplant-based clinical trial. At present, the risk/benefit ratio of such a clinical trial in youngsters with neuromuscular disease does not support it.

Information about the status of specific neuromuscular disease clinical trials is available on the Association's Web site at www.mdausa.org by clicking on "Research" and "Active Clinical Trials"."

USA - sarcoglicanopatias são formas recessivas de distrofia muscular tipo cinturas; neste estudo os cientistas criaram dois vetores vitais contendo os genes da alfa ou beta sarcoglicans. Os vetores foram injetados em camundongos que apresentavam deficiência destes sarcoglicans. Os camundongos com deficiência em beta sarcoglican tratados com o vírus correspondente apresentaram a expressão do gene por 21meses após o tratamento. No entanto os camundongos deficientes em alfa sarcoglicans e tratados com o vetor viral apresentaram resultados  nos primeiros dias mas após 21 a 28 dias apresentaram redução da expressão do gene e sinais de inflamação nos músculos; para tentar entender o que ocorreu os pesquisadores criaram camundongos deficientes em alfa sarcoglican e com deficiência imunológica e observaram que o mesmo fato ocorreu demonstrando a superexpressão do gene foi responsável pela toxicidade para as células. Novas pesquisas deverão esclarecer se será possível evitar este efeito tóxico desta terapia gênica e prolongar os efeitos positivos.

USA - alterações do equilíbrio do cálcio tem sido implicadas com as alterações musculares da distrofia muscular. Alguns trabalhos já tinham relacionado a calpaina dependente do cálcio com as alterações da distrofia muscular. Como a ativação da calpaína lesa o músculo ainda não tinha sido determinada. Para estudar a ação da calpaína na destruição muscular os pesquisadores criaram um camundongo com distrofia muscular que produzia um excesso de calpastatina. Calpastatina é um inibidor específico  da calpaína m e µ mas não inibe a calpaína 3 (p94). Dois grupos de camundongos foi criado de acordo com a quantida de calpastatina que produziam. Os dois grupos demonstraram redução da necrose. As lesões observadas foram poucas e pequenas. Os que tinham menos lesões produziam mais calpastatina. As alterações observadas demonstram que a calpaína tem um papel importante no processo de necrose do músculo na distrofia muscular e a inibição desta proteína (por terapia gênica ou medicamentos) pode ser uma opção de tratamento válida na distrofia muscular.  

USA - o aparecimento de tumores é um risco potencial da terapia gênica; um paciente com imunodeficiência e que recebeu terapia gênica na França com sucesso apresentou uma forma de leucemia. No momento ele está sendo tratado com quimioterapia com sucesso. No entanto as pesquisas com terapia gênica nesta forma de imunodeficiência foram suspensas na França e nos Estados Unidos. Existe a possibilidade desta leucemia não ter relação com a terapia gênica; no entanto só após um longo estudo (estimado em 18 meses) é que será possível chegar a alguma conclusão.

http://abcnews.go.com/wire/SciTech/reuters20021003_369.html

França e USA - as empresas Trangene e Mirus anunciaram hoje  a realização de uma pesquisa inédita: o uso de plasmídeos como vetor injetado por via intra-arterial utilizando a tecnologia da Mirus.  Esta tecnologia permitirá a eficiente entrega do gene ao músculo em pelo menos 10% dos grandes músculos do quadril em modelos animais. A tecnologia da Mirus consiste em um eficiente método de transferir com alta e controlada pressão os vetores do sangue ao músculo. Este método poderá abrir uma nova perspectiva para uma terapia gênica eficiente. A Transgene é a empresa que está realizando o primeiro estudo em humanos com terapia gênica na distrofia muscular de Duchenne e Becker.

Canadá -  com o intuito de melhorar o desempenho da terapia gênica, os pesquisadores desenvolveram um vetor viral contendo dois genes da distrofina e um promotor. Os resultados demonstraram uma grande expressão da dostrofina com a injeção do vírus por via intramuscular em camundongos adultos e neonatos. Nos camundongos neonatos a expressão foi 5 vezes superior ao músculo normal. Este grande aumento foi transitório e se seguiu ao aparecimento de uma reação imunológica. A aplicação da terapia em camundongos sem defesa imunológica demonstrou que a expressão do gene se mantinha por mais tempo. Este trabalho demonstra a viabilidade da terapia gênica e demonstra que durante este tratamento será necessária a utilização de drogas imunossupressoras.

USA -  contrariando as informações da semana passada (5/10/02) o FDA decidiu que as pesquisas com terapia gênica em humanos devem continuar até que se estabeleça a relação entre esta forma de tratamento e o aparecimento de tumores.

USA -  a mutação de ponto é uma causa infrequente de doenças genéticas como a distrofia muscular. Existem muitos estudos para a pesquisa de drogas que possam corrigir este defeito com drogas, como a gentamicina (notícia de 23/09/2002). Foi revelado em uma palestra esta semana na Sociedade Americana de Genética Humana que a empresa PTC Therapeutics tem uma quantidade de pequenas moléculas (com peso molecular menor que 500) que poderiam ser úteis nesta situação e que estariam sendo testadas em animais e pequenos vermes.

USA - Os pesquisadores da Universidade de Iowa estavam estudando um modelo em camundongo para desenvolvimento de distrofia muscular com a retirada de uma proteína, a distroglican. Inicialmente eles observaram que os animais apresentavam uma forma de distrofia muscular mas estranhamente estes camundongos mantinham a capacidade de regeneração muito alta. Alías eles apresentavam hipertrofia muscular (aumento do músculo maior que os animais do grupo controle). Os pesquisadores identificaram que um grupo específico de células musculares, denominadas células satélites eram produtoras de distroglicans e eram eficientes em restaurar o dano muscular da distrofia muscular. A pesquisa demonstrou que a manutenção da capacidade regenerativa das células satélites pode prevenir o desenvolvimento da forma severa da distrofia muscular. O mal funcionamento destas células pode influenciar na severidade da doença e pode ser um alvo de estratégias de tratamento. Uma outra descoberta da pesquisa é que as células satélites não perdem a capacidade de regeneração com a idade (não ficando exauridas com a idade). As células satélites funcionariam como as células tronco. Os animais que sofreram irradiação para destruir as células satélites apresentaram forma severa da distrofia muscular. Foram criados camundongos que não produziam distroglican nas células musculares e nas células satélites e eles também apresentaram forma severa da doença.

USA - neste Congresso realizado em Baltimore de 15 a 19 de outubro de 2002 foram apresentados vários trabalhos relacionados a distrofia muscular. Os mais importantes relacionados com o tratamento da doença estão aqui. Em um deles é descrito o uso de bifosfonato no tratamento da osteoporose de portadores de distrofia muscular e outras doenças genéticas; nos outros três são descritas formas de terapia gênica em modelos experimentais de distrofia muscular.

Canadá - uma das dificuldades enfrentadas para um bom resultado da terapia gênica é fazer com  que a maioria das células passem a expressar o gene que foi administrado. Estudos prévios tinham demonstrado que o uso de ultrassom contribuia para aumentar a permeabilidade à macromoéculas como o plasmídeo DNA, um vetor usado na terapia gênica. Na presente pesquisa os autores conseguiram aumentar a eficiência da terapia gênica em camundongos portadores de distrofia muscular utilizando o ultrassom; não ocorreu lesão muscular com o uso do ultrassom.

Dinamarca - a distrofia muscular é caracterizada por degeneração muscular e insuficiente regeneração e reposição das fibras musculares. Muitos pesquisadores estão procurando novas formas de produzir regeneração dos músculos. Neste trabalho os pesquisadores  estudaram o efeito da ADAM12, uma metaloprotease da membrana celular, normalmente associada a regeneração do músculo esquelético. Os pesquisadores demonstraram que a superexpressão da ADAM12 em camundongos com distrofia muscular reduz as alterações musculares; nestes camundongos ocorreu redução da necrose e inflamação, níveis baixos da enzima CK e menor coloração da fibra muscular pelo azul de Evans. O trabalho demonstra que o ADAM12 contribui, direta ou indiretamente, para a regeneração muscular, estabilidade e sobrevida.

Japão -  neste artigo que estuda várias formas de vírus no tratamento da distrofia muscular experimental em camundongos demonstrou-se que há uma resposta inflamatória nos músculos que receberam o tratamento com o vírus. Neste trabalho os pesquisadores tentam entender os motivos desta reação para tentar impedí-la ou minimizá-la

USA -  Os órgãos para transplante são escassos e podem causar rejeição; as células tronco são escassas e ainda há polêmicas para a sua utilização; os pesquisadores do Hospital Pediátrico da Filadélfia utilizando células tronco administradas no pré-natal e manipulação das células após o nascimento provocaram imunotolerância em camundongos permitindo que  eles doem células para muitas pessoas sem efeitos tóxicos. Este artigo foi publicado no número de agosto e setembro na revista Blood. Este achado pode aumentar as possibilidades de transplantes de órgãos e o uso em doenças genéticas como a leucemia, anemia falciforme, distrofia muscular e doenças hepáticas e renais. 

USA - 180 cientistas e médicos se reuniram no Arizona para discutir os recentes avanços em quatro doenças neuromusculares.

 Com relação a distrofia muscular de Duchenne os assuntos abordados foram:

-  as vantagens do tratamento com cortícoides para retardar a evolução da doença mas a necessidade de acompanhamento períódico para prevenção dos seus efeitos colaterais; foram discutidos esquemas de tratamento (diário, semanal, 10 dias com e 10 dias sem) e tipos de corticóides empregados (prednisona, deflazacort). 

- quando e por que realizar cirurgias ortopédicas 

- avanços na pesquisa da melhor forma de terapia gênica na distrofia muscular de Duchenne: que parte do gene é necessária, qual o melhor vírus para levar o gene, etc

- métodos para melhorar o diagnóstico da doença

Com relação a distrofia tipo cinturas foram abordados os seguintes assuntos:

- foram relatados os resultados de dois pacientes que receberam injeção do gene da sarcoglican no pé; uma apresentou pequena expressão da proteína enquanto o outro não. Estes resultados não foram conclusivos já que os pacientes com esta forma de distrofia podem apresentar a expressão do gene nos músculos do pé. Outros estudos serão realizados em breve.

- melhores formas de diagnosticar a doença podendo contribuir para esclarecer a evolução da doença de acordo com a alteração genética apresentada.

http://www.mdausa.org/news/021113phyreview.html

http://www.mdausa.org/news/021115sperep.html

USA -  Utilizando células tronco adultas  os cientistas da Universidade de Stanford conseguiram pela primeira vez demonstrar como, passo a passo, as células tronco se transformam em músculos. As células tronco, neste estudo publicado na revista Cell desta semana,  se transformaram em verdadeiros músculos prontas para corrigir músculos lesados. A pesquisa não utilizou camundongos com distrofia muscular mas a finalidade deste estudo é o entendimento de como tratar esta doença com células tronco. Inicialmente para realizar estes sofisticados experimentos os cientistas destruiram a medula óssea de camundongos com irradiação. Em seguida eles injetaram células tronco de um outro camundongo, modificado geneticamente para produzir uma proteína fluorescente, que poderia ser vista no microscópio. Após alguns meses eles detectaram células tronco específicas dos músculos, denominadas de células satélites, com coloração fluorescente em todo camundongo, demonstrando de fato que elas teriam se originado das células tronco transplantadas. Na parte mais interessante do trabalho eles dividiram os camundongos em dois grupos: um sedentário e outro que fazia constante atividade física (andar em rodas). Os camundongos que andaram cerca de 4 milhas por noite por seis meses brilhavam com mais intensidade que os outros, como se estivessem severamente lesados. Mas os pesquisadores observaram que as células tronco tinham se multiplicado e transformado em fibras musculares com capacidade de reparar a lesão muscular. Os camundongos sedentários também apresentaram células tronco músculo específicas fluorescentes mas os que tinham feito atividade física tinham 20 vezes mais fibras musculares. É provável, pelos resultados observados, que as células lesadas enviaram alguma forma de mensagem para atrair, multiplicar e diferenciar as células tronco. A descoberta desta forma de sinal pode ser muito útil no tratamento das doenças neuromusculares como as distrofias musculares. 

Austrália -  em um trabalho anterior este grupo de pesquisadores australianos tinha demonstrado que o uso da fator inibidor da leucemia melhoravas as alterações musculares da distrofia muscular. Nesta continuação da pesquisa que será publicada em breve na revista Neuromuscular Disorders eles observaram que este fator aumenta a proliferação dos mioblastos mas não reduziu as  alterações produzidas no músculo com distrofia muscular não demonstrando nenhum benefício significativo.

An evaluation of leukaemia inhibitory factor as a potential therapeutic agent in the treatment of muscle disease

The exogenous delivery of growth factors and cytokines is a potential therapeutic strategy to alleviate the degenerative effects of  primary inherited myopathies such as Duchenne muscular dystrophy. The mdx mouse diaphragm is a model for examining the progressive degeneration of dystrophic muscle. We have delivered leukaemia inhibitory factor to the mdx diaphragm using slow release alginate gels. Previous studies have reported an improvement in the histology of mdx diaphragms after delivery of leukaemia inhibitory factor in a similar manner, but little attention has been paid to the mechanism by which leukaemia inhibitory factor acts. We have used autoradiography to examine cell proliferation, Evans Blue Dye to examine myofibre damage, and morphometric analysis to examine histology in leukaemia-inhibitory-factor-treated diaphragms and compared them with untreated mdx and normal C57Bl10/ScSn diaphragms. Autoradiography showed that although myoblast proliferation was significantly increased in leukaemia inhibitory factor-treated mdx diaphragms, leukaemia inhibitory factor did not reduce myofibre damage and no histological improvement was observed. The data presented here, while demonstrating a role for leukaemia inhibitory factor in myoblast proliferation, do not support a strong and consistent benefit of leukaemia inhibitory factor on dystrophic muscle in vivo as a means of alleviating the effects of chronic dystrophic muscle degeneration.

Austrália - uma das formas de terapia gênica que estão sendo estudadas na distrofia muscular é a utilização de oligonucleotídeos; ao invés de substituir o gene defeituoso se utiliza uma sequência pequena de nucleotídeos com a finalidade de fazer a célula vencer o defeito genético e passar a produzir uma forma de distrofina com um pequeno defeito mas funcionante. Esta forma de tratamento está sendo testada em vários centros no Japão, Cingapura e na Austrália; há vários relatos anteriores desta técnica no itém antisense (http://www.distrofiamuscular.net\notisense.htm).  Nesta pesquisa em células de camundongo com distrofia os cientistas produziram várias  sequências de oligonucleotídeos que demonstraram sucesso e com menor tamanho e com resultados  mais efetivos com as células passando a sintetizar a proteína distrofina.

Canadá -  pesquisa apresentada por um grupo canadense no Congresso Americano de Cardiologia demonstrou que a terapia gênica é eficiente em pacientes com infarto do miocárdio. Utilizando a injeção do gene do hormônio de crescimento diretamente no músculo cárdiaco de pacientes que foram comparados aos que recebiam a medicação convencional. Após 3 meses não havia diferença entre os grupos mas após 6 meses os que receberam terapia gênica apresentavam condição cardíaca muito melhor.

USA - será publicado em dezembro o artigo já divulgado no site em 12/07/2002 sobre a criação de um camundongo que não produzia a miostatina; a ausência desta proteína causa redução das degeneração muscular na distrofia muscular experimental; a pesquisa de drogas que possam inibir a miostatina pode ser o caminho para um tratamento medicamentoso da distrofia muscular. A repercussão deste artigo está aqui e aqui. O boletim da Johns Hopkins está aqui.

USA - coincidentemente mais um artigo sobre a miostatina será publicado hoje. Neste estudo os cientistas utilizaram um anticorpo monoclonal para impedir a ação da miostatina e conseguiram reduzir a severidade das alterações musculares na distrofia muscular experimental. Este estudo apresenta resultados semelhantes aos do artigo anterior (24/11/02) com a vantagem de não necessitar de terapia gênica (o anticorpo é injetado e impede a ação da miostatina); não se determinou as consequências a longo prazo do bloqueio da miostatina. 

O resumo do artigo publicado na Nature segue abaixo:

Functional improvement of dystrophic muscle by myostatin blockade

Nature 420, 418 - 421 (2002); doi:10.1038/nature01154

SASHA BOGDANOVICH*†, THOMAS O. B. KRAG*†, ELISABETH R. BARTON*, LINDA D. MORRIS*, LISA-ANNE WHITTEMORE‡, REXFORD S. AHIMA§ & TEJVIR S. KHURANA*

* Department of Physiology and Pennsylvania Muscle Institute, University of Pennsylvania School of Medicine, 3700 Hamilton Walk, Richards A-601, Philadelphia, Pennsylvania 19104-6085, USA
‡ Musculoskeletal Sciences Department, Wyeth Research, Cambridge, Massachusetts 02140, USA
§ Division of Endocrinology, University of Pennsylvania School of Medicine, Philadelphia, Pennsylvania 19104, USA
† These authors contributed equally to this work

Correspondence and requests for materials should be addressed to T.S.K. (e-mail: [email protected]).

Mice and cattle with mutations in the myostatin (GDF8) gene show a marked increase in body weight and muscle mass, indicating that this new member of the TGF- superfamily is a negative regulator of skeletal muscle growth. Inhibition of the myostatin gene product is predicted to increase muscle mass and improve the disease phenotype in a variety of primary and secondary myopathies. We tested the ability of inhibition of myostatin in vivo to ameliorate the dystrophic phenotype in the mdx mouse model of Duchenne muscular dystrophy (DMD). Blockade of endogenous myostatin by using intraperitoneal injections of blocking antibodies for three months resulted in an increase in body weight, muscle mass, muscle size and absolute muscle strength in mdx mouse muscle along with a significant decrease in muscle degeneration and concentrations of serum creatine kinase. The functional improvement of dystrophic muscle by myostatin blockade provides a novel, pharmacological strategy for treatment of diseases associated with muscle wasting such as DMD, and circumvents the major problems associated with conventional gene therapy in these disorders.

Comentários da revista sobre o artigo: Myostatin is a negative regulator of muscle mass — a mutant myostatin is responsible for the exaggerated musculature in Belgian blue cattle. Blockade of myostatin activity in the mdx mouse model for Duchenne muscular dystrophy with a monoclonal antibody is now shown to improve muscle function and cause a significant increase in muscle size. Myostatin blockade would be an attractive strategy for treating muscle degeneration diseases, as it would avoid some of the problems associated with conventional gene therapy 

França - o Instituto de Miologia da França em conjunto com a empresa Transgene está realizando a primeira pesquisa em terapia gênica em pacientes com Distrofia Muscular de Duchenne/Becker (notícia divulgada no site em 11/06/2002). O resultado que estava programado para este final do ano deverá demorar mais tempo. Através do e-mail recebido do Instituto fui informado que o último paciente esta sendo incluído no estudo e os resultados serão divulgados no começo de 2003. A integra do e-mail é o que segue:

"Dear Dr. Feder,

Thank you very much for your mail and for your interest in neuromuscular
disorders. To answer your question, the trial on Duchenne muscular
dystrophy is not yet completely finished, currently the last patient is
enrolled. This means that the results of the trial will probably be known
by early next year.

I hope this is helpful,
Yours sincerely,

Jacques Salama
Secretaire General"

O resumo desta pesquisa em inglês segue abaixo: Current protocol of a research phase I clinical trial of full-length dystrophin plasmid DNA in Duchenne/Becker muscular dystrophies Part II: clinical protocol

Norma Beatriz Romeroa,*, Olivier Benvenisteb, Christine Payana, Serge Braunc, Patrick Squibanc,Serge Hersonb, Michel Fardeaua

A phase I clinical study on gene therapy in Duchenne and Becker muscular dystrophy, open, without direct individual benefit for thepatient, is being performed at the Pitie´-Salpeˆtrie`re Hospital, Paris. The aims of this project are: (a) to determine the tolerance and the safety of the intramuscular administration of dystrophin cDNA and (b) to study the quality of the gene transfer in vivo in human patients affected byDuchenne and Becker muscular dystrophy. This clinical trial is conducted sequentially and includes three cohorts of three patients each. Patients must be at least 15 years of age. Diagnosis of Duchenne and Becker muscular dystrophy was confirmed by molecular analysis of the dystrophin gene and for each patient the abnormal expression of dystrophin was confirmed, in skeletal muscle, with antibodies directed against the deleted part of the dystrophin. This phase I study is scheduled to be completed by the end of 2002. 

Suiça e Inglaterra: a bactería E.coli é uma fábrica produtora de proteínas para o homem (como a insulina, hormônio de crescimento, etc). No entanto ela não tem a capacidade de glicosilar proteínas. Como explicamos no artigo acima o defeito glicosilação de proteínas pode desencadear algumas formas de distrofia muscular e outras doenças clínicas (como a artrite reumatóide). Neste estudo os pesquisadores transferiram  o sistema responsável pela glicosilação de proteínas da bactéria Campilobacter jejuni para a E.coli. Com isto a E.coli passará a produzir as proteínas glicosiladas e poderá servir para estudar como funcionam estas proteínas e como corrigir o defeito nas células humanas.

Inglaterra - a utrofina é uma proteína presente na célula que pode fazer o mesmo efeito da distrofina e melhorar os sintomas da distrofia muscular. Este é mais um trabalho que demonstra os efeitos benéficos da utrofina em um modelo de distrofia muscular em camundongos. O que é diferente neste estudo é que o aumento da utrofina em camundongos foi obtida com a adição do antibiótico tetraciclina na água. O tratamento foi realizado em quatro épocas diferentes: no útero, ao nascimento, 10 e 30 dias após o nascimento. O resultado mostrou menor lesão muscular, não houve alteração da força mas ocorreu aumento significante da resistência muscular. Nos animais tratados com 30 dias do nascimento os resultados foram muito pequenos. Além disso os pesquisadores observaram que os canais de cálcio se normalizaram com a expressão da utrofina demonstrando o papel do cálcio nas alterações musculares da distrofia. Em resumo este trabalho demonstrou que a utrofina pode corrigir as alterações da distrofia, especialmente quando realizada logo ao nascimento e dependendo da quantidade de utrofina das células musculares.

USA - em março de 2001 quando iniciamos o site divulgamos uma promissora notícia sobre uma nova modalidade de terapia gênica: a utilização do gene da alfa 7 beta 1 integrina no tratamento de um modelo experimental de distrofia muscular. O artigo veio ilustrado por um interessante  vídeo das pesquisas (http://www.jcb.org/cgi/content/full/152/6/1207/DC1/1) (para visualização do vídeo que tem 11,5MB, você precisa do quick time player). Após 21 meses não houve nenhuma continuidade da pesquisa e nenhum outro pesquisador realizou estudos nesta mesma linha. 

USA - Stephen Kaufman, cientista que está estudando a integrina no tratamento da distrofia muscular enviou a seguinte resposta a Berit Sofie a respeito de sua pesquisa: que a integrina é uma alternativa interessante e promissora no tratamento da distrofia muscular; que ele continua estudando o tema e que ele acredita que outros pesquisadores estejam estudando o tema e que há um caminho ainda longo para os testes em seres humanos.

"Dear Berit,
In the article you refer to we report an interesting and encouraging alternative approach to DMD. We continue to work on this and I believe other labs may also have taken this cue.  At this point, unfortunately, we are years away from knowing whether this approach will lead to a meaningful clinical intervention in humans.  I assure you we continue to work on this diligently.
Sincerely,
Stephen Kaufman"

Um dos maiores problemas da terapia gênica é a capacidade de levar o gene até a célula e fazé-lo funcionar. Neste estudo em células musculares de porcos os pesquisadores utilizaram um vírus para levar o hormônio de crescimento para as células. Para melhorar a eficiência desta terapia eles utilizaram uma corrente elétrica de baixa intensidade. Através desta corrente elétrica foi possível  utilizar pequena quantidade de vírus. O estudos realizados mostraram que o gene passou a realizar o seu efeito: houve aumento do peso, diminuição da gordura e aumento da densidade óssea. O estudo comprovou que a corrente elétrica otimiza a terapia gênica.

Muitas pesquisas importantes divulgadas em 2001/2002 não tiveram continuidade ou delas não tivemos mais notícias. Pais de portadores de distrofia estão entrando em contato com pesquisadores para solicitar mais informações ou para mostrar aos cientistas que os pais estão com pressa nas pesquisas. A nossa amiga Julie Garcia da Califórnia conseguiu uma resposta do Dr. Eric van Lunteren sobre a pesquisa com o uso de inibidores dos canais de potássio na distrofia muscular experimental (Inotrophic effects of the K(+) channel blocker TEA on dystrophic (mdx and dy/dy) mouse diaphragm). Neste e-mail  Eric responde que não tem informações sobre o uso de bloqueadores dos canais de potássio na distrofia muscular e não sabe dizer se serão usados clinicamente. Ele faz pesquisas básicas e não está envolvido com o tratamento de pacientes com distrofia muscular. 

Pesquisadores de ciências básicas não sabem muito sobre as distrofias musculares e sobre a necessidade de urgência nas pesquisas.

I am not aware of any data on the use of K+ channel blockers for the treatment of humans with muscular dystrophy, so I really can't tell you how useful this will turn out to be clinically.  Although I do basic research in this area, I am not very involved in the clinical treatment of people with muscular dystrophies.  Thus it is possible that there may be some information along the lines you are seeking without my being aware of it.  Sorry I can't be of much help beyond this.

Erik van Lunteren

A nossa amiga Berit Sofie da Noruega conseguiu a seguinte resposta do Dr. Jeffrey S Chamberlain que tem uma linha de pesquisa muito sólida em distrofia muscular e é um dos pesquisadores mais dedicados na pesquisa da cura da doença com a terapia gênica.

Gene therapy of muscular dystrophy

Adeno-associated virus vector-mediated gene transfer into dystrophin-deficient skeletal muscles evokes enhanced immune response against the transgene product

Functional correction of adult mdx mouse muscle using gutted adenoviral vectors expressing full-length dystrophin

Neste e-mail o Dr. Chamberlain afirma que o objetivo de seu laboratório. O principal foco de pesquisa é como levar o gene para o tratamento. Os problemas para a efetivação da terapia gênica mas estão sendo feitos progressos. Ela faz pesquisas com camundongos que tem uma doença semelhante à humana. A administração do gene antes do desenvolvimento da doença pode prevenir a sua ocorrência. Ele está também pesquisado os efeitos da terapia gênica em camundongos que já apresentam alterações musculares tentando reverter os sintomas da doença. As pesquisas são divididas em três etapas. Primeiramente ele esta estudando transportadores do gene até o músculo. Segundo ele está pesquisando maneiras de avaliar corretamente a força muscular e analisar o resultado da terapia gênica. Terceiro ele está fazendo formas diferentes de distrofina, pequenas e grandes e colocadas em diferentes transportadores. Ele usa vírus como transportadores do gene, que são preparados em laboratórios sendo retirados genes do vírus que podem causar efeitos ruins. Ele tem bons resultados com dois vírus que já provaram sua capacidade em transportar o gene da distrofina aos músculos. Importante é que este processo pode acarretar lesão muscular que pode ser em parte revertida. A importância deste trabalho é que esta forma de terapia gênica demonstrou capacidade de reverter as alterações já existentes no músculo, o que abre a perspectiva de cura da doença mesmo com a lesão já estabelecida. Ele enfatiza que todos os estudos são feitos em camundongos e não há testes seguros em seres humanos. Ele também explica que os trabalhos demonstram efeito em um músculo e outros estudos deveram ser feitos para tratar todos os músculos. Ele acredita que iniciará estudos em seres humanos nos próximos 2 a 3 anos para testar a segurança do procedimento. Ele termina relatando que tem um grupo dedicado e que está trabalhando intensamente para resolver os problemas da terapia gênica.

Dear Berit,

Thank you for your interest in our work.  The goal of our lab, and many others, is to find a way to use gene therapy to treat muscular dystrophy.  Our main focus is on Duchenne Muscular Dystrophy (DMD), but we feel that the methods used to deliver a gene to muscle should be generally applicable to most types of muscular dystrophy.  The difficulties in developing gene therapy are many, but we are making good progress.  The studies now being performed all use animal models for muscular dystrophy.  My lab studies a strain of mice that have the same genetic defect as do patients with DMD.  These mice therefore allow us to test many potential approaches for therapy.  Previous work in mice has shown that if a new dystrophin gene can be delivered to muscle before the disease develops, that dystrophy can be prevented from occurring.  However, we are also interested to find out whether it might be possible to halt the disease, or even reverse some of the muscle damage, after the disease has already developed.  
We have taken several approaches to answering these questions.  First, we have been developing ‘shuttles’ that allow genes to be transferred into muscle cells.  Second, we have been developing ways to measure muscle function in the mice, so that we can find out what effects gene transfer has on muscle.  Third, we have been making many different types of dystrophin genes, both large and small versions, so that we have available several options to use with our different shuttles.  The shuttles are made from viruses, but first we remove from the virus those genes that might otherwise cause illness.  We have obtained encouraging results with two shuttles, adeno-associated virus, and adenoviral shuttles, each of which have been stripped of all viral genes.  Our most recent studies showed that the so-called “gutted’ adenoviral shuttle could transfer the full dystrophin protein to muscle cells.  Importantly, we found that when the gene was delivered to muscles of mice that had already developed a lot of muscle damage, we were able to reverse some of that damage. The importance of this work is that we now know that if the dystrophin gene and protein can be replaced in muscles, then it should be possible to not only halt the disease from getting worse, but also to reverse at least some of the pre-existing muscle damage.
It is important to remember that all of this work has been done in mice.  Also, the shuttles we are using have not been fully tested for their safety in humans.  Third, at present we are able to treat only a fairly small amount of muscle, even in the mice.  Thus, we still have a lot of work to do before we can hope to apply these results to patients.  We are continuing to test the safety of the shuttles, and we are working hard to find ways to deliver them to all the muscles of the body.  It is likely that we will be able to begin some very limited human clinical trials in the next 2-3 years that will be intended to test safety, and safety alone. We hope to use the adeno-associated virus vector in these studies.  If those studies go well, and if we can improve our methods to deliver shuttles to muscle, we would then be in a position to begin trying to improve muscle strength in patients.  I hope this work can proceed quickly, but it is very difficult work and very time consuming.  Nonetheless, I have a very dedicated group of scientists working extremely hard on these problems.

 With best wishes

Jeffrey S. Chamberlain, Ph.D. 

As células tronco são consideradas como alternativa futura para o tratamento definitivo das distrofias musculares. Neste artigo os pesquisadores fazem uma revisão dos procedimentos e dificuldades para levar os genes para células tronco atráves de vetores virais. O sucesso deste procedimento será muito importante nas distrofias musculares.

 

USA - O FDA, agência americana de controle de medicamentos, alimentos e procedimentos médicos suspendeu por precaução trinta estudos em seres humanos utilizando vetores virais para corrigir defeitos em células tronco. Esta medida foi tomada após o aparecimento do segundo caso de leucemia em um paciente que recebeu tratamento para imunodeficiência (os dois casos ocorridos na França). Estes pacientes que são chamados de "meninos da bolha" por que precisam ficar isolados para não adquirir infecções (como foi mostrado em um filme bem antigo de televisão) estavam sendo submetidos ao tratamento com suas próprias células tronco que eram corrigidas em laboratório por vetores virais. Em outubro de 2002 o primeiro caso de leucemia nestes pacientes foi descrito e agora com o segundo caso o FDA resolveu suspender o procedimento nos Estados Unidos e abrir uma investigação. O tratamento com células tronco vinha sendo muito bem sucedido nesta doença e a suspensão das pesquisas causará um atraso na busca da cura desta e de todas as doenças genéticas.

USA -  cientistas americanos estão analisando as causas de leucemia nos dois pacientes franceses  com imunodeficiência que receberam a terapia gênica. A análise inicial mostra que o problema pode ter ocorrido por que o gene foi introduzido ao lado de um gene que pode desencadear este tipo de tumor. O esclarecimento completo e rápido é necessário para a liberação dos estudos com terapia gênica nos Estados Unidos.

Inglaterra - neste artigo de revisão o autor aborda as possibilidades de tratamento das doenças neuromusculares, os avanços realizados e as dificuldades encontradas para fazer com que a maioria das células musculares passem a expressar o gene e permitir a melhora da função muscular.

Japão - o uso de corrente elétrica (electroporation) já demonstrou em outros estudos que aumenta a transferência dos genes para os músculos; neste estudo os pesquisadores demonstraram que a corrente elétrica aumenta a transferência do gene integral da distrofina em grande porcentagem de fibras musculares.

USA - a inibição da  miostatina já demonstrou aumentar a força muscular em camundongos com distrofia muscular. Neste estudo os pesquisadores quiseram testar em camundongos adultos se a inibição da miostatina promoveria o aumento muscular. Os camundongos receberam anticorpo anti-miostatina  e apresentaram aumento da massa e da força muscular. 

USA - pesquisadores americanos, que foram os descobridores das células tronco, conseguiram pela primeira vez repor um gene nas células tronco. Este procedimento poderá ser muito útil em pacientes com distrofia muscular e é um dos modelos que deverão ser estudados nesta doença: retirar células tronco de pessoas com distrofia, corrigí-las em laboratório e injetá-las nos músculos.

USA - Esta semana foram divulgados os mais de 1500 trabalhos que serão apresentados no Encontro Anual da Academia Americana de Neurologia que realizar-se-á de 29 de março a 5 de abril de 2003 no Hawaii. Destes artigos selecionamos 24 que se relacionam a distrofia muscular e estão relacionados aqui. Os principais são: 

- o artigo número 1 que mostra que os pacientes com Duchenne tratados com corticóides mantém a marcha por mais de 3 anos em relação aos que não usam e tem menor grau de escoliose. Os tratados com corticóides apresentaram maior incidência de fraturas inclusive com compressão vertebral, que pode ser explicada por maior atividade e maior incidência de osteoporose.

- o artigo 2 descreve o uso da ressonância nuclear magnética para avaliar o acometimento dos músculos que será um exame muito utilizado num futuro próximo.

- o artigo 3 demonstra que o ecocardiograma é o melhor exame para avaliar a função cardíaca em mulheres que são portadoras do gene da distrofina  e que a realização do ecocardiograma ao esforço demonstrou anormalidades em 83% das portadoras assintomáticas indicando que elas devam ser acompanhadas para o diagnóstico (as mulheres estudadas estavam com idade entre 37+ 10 anos)

- o artigo 4 descreve um novo vetor para levar o gene até o músculo com bons e prolongados resultados.

- o artigo 5 demonstra os bens resultados da terapia gênica em camundongos utilizando corrente elétrica mas há um declínio da expressão do gene ao longo do tempo que deverá ser estudada; pelo resultado exposto a terapia gênica se bem sucedida deveria ser repetida mais de uma vez.

- o artigo 6 estuda aspectos da lesão muscular da distrofia e o papel dos receptores e do fator de crescimento plaquetário nas lesões observadas.

- o artigo 14 e 15 descrevem alterações no sistema nervoso central de portadores de distrofia miotônica; no artigo 14 são analisadas alrterações na distrofia muscular miotônica congênita que apresentam alterações compatíveis com retardo mental e atraso do desenvolvimento. Não há adequada explicação para estas alterações.

Canadá - este grupo canadense está se dedicando a aperfeiçoar o transplante de mioblastos, inclusive em seres humanos. Neste trabalho eles retiraram mioblastos de camundongos com distrofia muscular e no laboratório corrigiram o defeito genético do mioblasto ou seja, utilizando um vetor viral que levou o gene da distrofina até o núcleo dos mioblastos eles conseguiram transformar estas células em normais. Estes mioblastos foram injetados em um músculo da pata do camundongo  que apresentou expressão do gene em porcentagem bem significativa, maior quando os camundongos recebiam drogas imunossupressoras. 

Inglaterra -  modificações dos genes é uma forma em estudo para tratamento das doenças genéticas; no entanto, os métodos que levam os genes até as células ainda não foram aperfeiçoados: há alguns riscos envolvidos e problemas com o uso dos vírus com esta finalidade. Pesquisadores do Imperial College London e da  Medical Research Council da Inglaterra desenvolveram um método efetivo de levar o gene até as céulas sem o uso de vírus.  Eles estudaram em camundongos o uso de microbolhas associadas com o uso do ultrassom. O estouro destas microbolhas, que são injetadas na veia, causa pequenas lesões na membrana da célula e permite a entrada do DNA. O ultrassom é utilizado para direcionar estas microbolhas. Esta terapia que só foi testada em animais pode ser efetiva no tratamento das distrofias musculares.

http://www.health-news.co.uk/showstory.asp?id=107274

http://www.betterhumans.com/News/news.aspx?articleID=2003-02-24-3

http://reuters.com/newsArticle.jhtml?type=healthNews&storyID=2278965

USA - nesta pesquisa realizada pela equipe da Universidade de Pittsburgh os animais deficientes em distrofina no coração receberam injeções no músculo cardíaco de células tronco derivadas dos músculos de camundongos normais. Os animais foram estudados após 2, 4 e 8 semanas deste procedimento. As células sobreviveram no músculo cardíaco e passaram a produzir  distrofina após 4 a 8 semanas do procedimento. Novos estudos serão feitos para avaliar a função cardíaca com este procedimento.

USA - a eficiência da terapia gênica é significantemente maior com o prétratamento com hialuronidade e a aplicação de corrente elétrica seguida da injeção do plamídeo com o gene da distrofina, processo denominado de de eletrotransferência. Na distrofia muscular de Duchenne há um aumento do tecido fibroso que poderia prejudicar esta terapia. Neste trabalho os pesquisadores demonstram que este processo é possível em células musculares de camundongos com distrofia e que o processo não promove nenhuma lesão adicional no músculo. No entanto a aplicação de hialuronidade previamente não aumenta os resultados deste tratamento. Não há diferença em relação ao sexo e a idade dos camundongos. Portanto este tratamento se mostrou eficiente em laboratório nas células musculares de camundongos com distrofia muscular.

Inglaterra - utilizando uma técnica já descrita por outros pesquisadores e relatada no site no dia 12/01/03 os pesquisadores ingleses estão tentando com células de portadores de atrofia espinal a correção do mRNA, intermediário entre o DNA e a síntese de proteínas. 

USA - muitas pesquisas estão sendo feitas para encontrar a melhor maneira de levar os genes até as células musculares na distrofia. Nesta pesquisa da pesquisadores da Carnegie Mellon University os cientistas estão descrevendo particulas muito pequenas que podem transportar os genes até as células, sem a necessidade de transportadores virais. É uma pesquisa bem inicial mas pode produzir bons resultados.

Holanda - uma linha de pesquisa que está sendo desenvolvida na Holanda, Japão, Austrália, Cingapura e outros centros é a da correção do defeito genético; utilizá-se oligonucleotídeos que ajudam a célula a suplantar o ponto de mutação e produzir distrofina. Neste trabalho eles utilizaram células de 6 diferentes pacientes e no laborátorio esta técnica deu excelente resultado: mais de 75 por cento das células passaram a produzir distrofina. A produção se iniciou com 16 horas do processo com pico de 2 dias e se manteve por pelo menos uma semana. Este é um bom caminho para as pesquisas.

Itália - A utrofina é uma proteína semelhante a distrofina e tem sido usada com sucesso na terapia gênica experimental em camundongos deficientes em distrofina. Os pesquisadores construiram um vírus com um minigene da utrofina e injetaram este vírus no músculo tibial posterior de cães labrador  recém-nascidos (cães com distrofia muscular). Os animais foram estudados 10, 30 e 60 dias após o tratamento, sendo que alguns animais receberam medicação imunossupressora e outros não. Os animais que receberam drogas imunossupressoras expressaram a utrofina por pelo menos 60 dias, tiveram menor quantidade de fibrose e apresentaram aumento das proteínas associadas a distrofina indicando que a utrofina pode compensar a ausência da distrofina. O resultado demonstra que a utrofina pode ser uma alternativa válida para terapia gênica de pacientes com distrofia muscular de Duchenne.

USA -  Pesquisadores de três paises, patrocinados pela Associação Americana de Distrofia (MDA) conseguiram corrigir o defeito genético desencadeante da distrofia muscular miotônica e outras doenças genéticas com mínimos danos à estrutura das células. Nesta forma de distrofia o gene está aumentado pela proliferação de bases (ver detalhes da doença aqui). Os cientistas conseguiram "cortar" estas bases em excesso. Os estudos iniciais mostram alguma melhora da função das células

USA - este estudo foi realizado em laboratório com as células musculares dos camundongos com distrofia muscular. Utilizando oligonucleotídeos de RNA/DNA os pesquisadores conseguiram corrigir a mutação e fazer a célula produzir distrofina com a restauração da funcionalidade da membrana celular. Esta seria uma nova maneira de corrigir o defeito da célula tornando a doença mais amena (transformando a distrofia muscular de Duchenne em Becker).

França: anteriormente já tinhamos divulgado que os pesquisadores franceses estavam testando a terapia gênica em pequeno número de pacientes com Duchenne e Becker; esta pesquisa visava exclusivamente testar a segurança desta terapia. Os vírus contento os genes foram injetados diretamente no músculo do antebraço dos pacientes e estes foram estudados alguns meses após. Os resultados demonstraram pela primeira vez que os músculos expressaram a distrofina e que não desencadearam alterações prejudiciais aos músculos. Esta pesquisa será divulgada no Congresso Anual da Sociedade Americana de Terapia Gênica que se realizará em junho nos Estados Unidos.

Results of Phase I Clinical Trial of Plasmid-Dystrophin Intramuscular Administration into Duchenne and Becker Dystrophy Patients - that will be presented on the 6th Annual Meeting of American Society of Gene Therapy in June 4-8,2003, in Washington. 

Norma B. Romero,1 Olivier Benveniste,2 Aurore Choquel,2 Christine Payan,1 Glenn E. Morris,3 Jean-Gerard Guillet,4 Jean-Claude Kaplan,4 France Leturcq,4 Serge Braun,5 Brigitte Mourot,5 Christine Thioudellet,5 Patrick Squiban,5 Serge Herson,2 Michel Fardeau.1

1Institut de Myologie, Groupe Hospitalier Pitié-Salpêtrière, Paris, France; 2Clinical Medicine, Groupe Hospitalier Pitié-Salpêtrière,Paris, France; 3North East Wales Institute, Wrexham, UnitedKingdom; 4ICGM - INSERM U445, and Groupe Hospitalier Cochin Port-Royal, Paris, France; 5Transgene S.A., Strasbourg, France.

Duchenne dystrophy is a recessive X-linked inherited disorder with deletions or mutations in the dystrophin gene. Clinical onset occurs usually before the age of four years and is fatal (death during the third decade of life). A milder form (Becker dystrophy) is of more variable phenotype, but with abnormalities in the same dystrophin gene. After extensive pre-clinical studies in mdx mice and GRMD dogs we have carried out the first gene therapy phase I clinical trial in both Duchenne and Becker patients. The goal of this study was to provide indications on safety of a full-length human dystrophin-plasmid administration and exogenous dystrophin expression in DMD/BMD patients. Many ethical aspects were considered, including age and sequential inclusion of the patients, and low plasmid dosage. Complete data of each patient was carefully analysed by a steering committee composed of investigators, promoters and external, independent experts, before enrolment of the following patient. Three cohorts of 3 patients, presenting with large deletions, were injected in the radial muscle with either a single injection of 200 µg (cohort 1) and 600 µg (cohort 2) of plasmid, or 2 injections 2 weeks apart with 600 µg plasmid (cohort 3). In all patients, a muscle biopsy was performed in the injected site 3 weeks after the first injection. Each biopsy was serially sectioned and studied for the presence of plasmid (PCR) and for dystrophin expression (nested RT-PCR + immunohistochemistry). The histological aspect of the muscle biopsy and local inflammatory processes were analysed. Besides the usual biochemical / cytological blood parameters (including muscle enzymes), patients were also followed for specific immunological endpoints (anti-DNA and antidystrophin cellular and immunological responses) for 3 months after plasmid injection. Normal dystrophin expression was found in few muscle fibers of 2/3 patients of the first cohort and in 1/3 patients of the second cohort. All the 3 patients of the 3rd cohort displayed significant amounts of weakly dystrophin-stained muscle fibers. Plasmid was detected in the injected muscle sample in all patients. All patients showed perfect tolerance to the plasmid administration. Neither anti-DNA nor anti-dystrophin immune response was found. As demonstrated by MRI, EMG and muscle strength analysis, the procedure did not impair the injected muscle function. These results show for the first time that exogenous dystrophin expression can be obtained in DMD/BMD skeletal muscle in vivo following gene transfer, and without adverse effects. This very cautious approach paves the way for further developments. We are currently working extensively (in collaboration with JA Wolff and Mirus Corp.), on a more ambitious, intra-arterial delivery administration of human full-length dystrophin plasmid, that we intend to evaluate in a next human clinical trial

USA - de 4 a 8 de junho de 2003 será realizado o Encontro Anual da Sociedade Americana em terapia gênica; neste encontro os maiores pesquisadores em terapia gênica irão apresentar seus trabalhos. Vinte e sete destes trabalhos se referem a pesquisas em terapia gênica na distrofia muscular. Os resumos destes trabalhos em inglês estão aqui. Todos eles demonstram avanços na terapia gênica experimental. Tentarei fazer um resumo das principais pesquisas nos próximos dias. O conteúdo dos primeiros resumos:

1) Sucesso com oligonucleotídeos para terapia gênica

2) Sucesso na correção da distrofia muscular experimental intra-útero

3) Uso da gentamicina na mutação de ponto: descrição de um teste que demonstra os prováveis pacientes que se beneficiarão do tratamento.

4) Sucesso na terapia gênica com vetor viral

5) Sucesso da terapia gênica no músculo diafragma utilizando vetor viral e gel.

6) Terapia gênica com sucesso em um modelo de distrofia tipo cinturas com gene liberado por via intraarterial

7) Uso de terapia gênica utilizando o Igf-1

8) Terapia gênica com um indutor de formação de vasos, o VEGF 165, induzindo  a regeneração dos músculos.

9) Descrição de um novo modelo de distrofia muscular em cães.

10) Sucesso com o uso do mini-gene da distrofina em cães com distrofia muscular

11) Explora o uso do vetor lentiviral em modelos de distrofia experimental; o vetor lentiviral é maior que o AAV e facilita a colocação do gene da distrofina

12) Discute as alterações da células musculares dos vasos dos músculos e a importância da introdução do gene da distrofina também nestas células.

13) Demonstra os resultados positivos do minigene da distrofina em modelos experimentais, com aumento da força muscular.

14) Estuda a relação entre o aumento da utrofina e a redução da calpaína em camundongos que receberam o gene da distrofina; a utrofina pode exercer o mesmo papel da distrofina.

15) Estudo com o uso da corrente elétrica para melhorar a passagem do gene para as células musculares.

16) Obteve maior sobrevida dos mioblastos com a utilização da interleucina 10 por terapia gênica em camundongos.

17)  Apresenta um estudo sobre as diferentes formas de célula tronco.

18) Demonstra que a superexpressão da matrilisina aumenta a migração dos mioblastos e reduz a necessidade de tantas injeções.

19) Estuda maneiras de modificar os mioblastos antes do transplante para evitar rejeição.

20) Analisa as possiblidades de terapia gênica na cardiomiopatia das distrofias.

21) Demonstra os bons resultados da terapia gênica intra-útero (antes do nascimento)

22) Estudo o uso de oligonucleotídeos  na  distrofia miotônica (estuodo in vitro,em laboratório) 

23) Observou que a injeção de células tronco por via intramuscular aumenta a expressão da distrofina e que o transplante de medula óssea não produziu efeito.

24) Estuda a manipulação prévia (em laboratório) das células tronco para terapia gênica

25) Utiliza na terapia gênica vetores com distrofina e proteínas imunossupressoras e obtem a expressão do gene por mais tempo.

26) Demonstra os efeitos do minigene da proteína agrin em camundongos com uma forma de distrofia muscular congênita

27) Estuda a terapia gênica nas células satélites dos músculos responsavéis pela regeneração muscular.

Suiça - existem várias modalidades de terapia gênica sendo testadas. Neste estudo os pesquisadores tentam fazer a célula passar a produzir distrofina, através da utilização de uma sequência de oligonucleotídeos que copia o DNA, vencendo a mutação. Os resultados desta técnica foram favoráveis.

USA -  um artigo que será publicado na revista Drug & Market Development fala sobre os atuais conhecimentos a respeito das distrofias musculares. Há um resumo sobre os genes defeituosos nas distrofias, a incidência da doença, as tentativas de correção da doença por terapia gênica e sobre o uso de células tronco. Um dos parágrafos da conclusão fala da importância da realização de estudos para retardar ou parar a evolução das doenças visto que há um longo caminho até que a terapia gênica esteja disponível. Este é um ponto do grupo FFF - Fight for a Future que pretende investir nesta linha de pesquisas. O resumo disponível do artigo segue abaixo:

IN PRESS: Drug & Market Development) Muscular Dystrophies: Recent Milestones 

• This article was been written by G. Thor, PhD and J. Terryberry, BS, who are associated with NeuroConsultants based in San Diego, [email protected]

• Gene therapy human clinical trials have been reactivated after a 2-year freeze. Several gene therapeutic approaches to study Muscular Dystrophies (MD) – a set of neuromuscular diseases wherein muscle atrophies - are being resumed in clinical and preclinical stages.

• About one in 3,000 boys, independent of ethnic background, is born with this disease, which is caused by a mutation or damage of the Duchenne or Dystrophin gene carried on the X chromosome.

• More than 90% of MD genetic defects have been identified and have led to several components of the Dystrophin Glycoprotein complex that are in turn being used as targets for disease manipulation.

• Genetic tests for detecting alterations in the Dystrophin gene or Creatine Kinase detection by a blood test are available for prenatal screening.

• Prevention of MD by gene transfer in a mouse model and the creation of dog models that mimic Muscular Dystrophies phenotypes are enabling researchers to design effective strategies to study and conquer this set of musculature related diseases.

• Stem cell research has gained ground as mice models prove to be rewarding testing grounds for therapeutic manipulation of Dystrophin and other related polypeptides of the Dystrophin Glycoprotein Complex (DGC).

IMPORTANT IN THIS ARTICLE IS THIS CONCLUSION: Although gene therapeutic approaches offer the most promise for an ultimate cure for DMD, gene therapeutics are not expected to be available for several years or longer, meaning that many patients diagnosed at the present time are not likely to benefit from gene therapy. Since the incidence of DMD in the US is about 100,000 new cases per year, DMD is not an orphan disease. Pharmaceutical companies should therefore be interested in developing drugs for DMD; since Orphan Drug status is not applicable. Furthermore, developing drugs for DMD could be made more attractive to pharmaceutical companies as part of an idea to discover drugs for muscle weakness. Synthetic Dystrophin will not pass through the muscle cell membrane and must be produced or introduced inside the membrane by the muscle cell to be effective. WE NEED SAFE TREATMENTS TO DELAY/STOP THE EVOLUTION OF THE DISEASE.

 

Canadá - nesta pesquisa os cientistas injetaram em um músculo da perna um vetor viral com o gene da distrofina. Os estudos foram realizados em camundongos recém nascidos e com 4 a 6 semanas de vida. Os resultados demonstraram que no primeiro grupo 42% das fibras expressavam a distrofina após 10 dias e que esta expressão se mantinha por 6 meses após este tratamento. No grupo com maior idade a expressão caia ao longo do tempo. Uma resposta inflamatória foi observada nos camundongos mais velhos. Este é mais um grupo de pesquisa que demonstrou bons resultados experimentais em camundongos.

Canadá - nesta pesquisa os cientistas injetaram em um músculo da perna um vetor viral com o gene da distrofina. Os estudos foram realizados em camundongos recém nascidos e com 4 a 6 semanas de vida. Os resultados demonstraram que no primeiro grupo 42% das fibras expressavam a distrofina após 10 dias e que esta expressão se mantinha por 6 meses após este tratamento. No grupo com maior idade a expressão caia ao longo do tempo. Uma resposta inflamatória foi observada nos camundongos mais velhos. Este é mais um grupo de pesquisa que demonstrou bons resultados experimentais em camundongos.

França - um mês após a notícia ser divulgada por este site (05/05/03), a Transgene e a Associação Francesa contra as miopatias divulgam oficialmente os resultados do primeiro estudo com terapia gênica em portadores de distrofia muscular de Duchenne e Becker. A notícia também foi divulgada pelo site da MDA.

USA - neste relato breve o autor descreve o papel da Interleucina 4 na função e atividade dos mioblastos. O autor relata que a utilização desta interleucina pode melhorar os resultados da terapia gênica.

A cytokine that packs a punch 

The Journal of Cell Biology, Volume 161, Number 5, 835-a-835

Muscle cells undergo an unusual developmental program in which several partially differentiated cells called myoblasts fuse to form a multinucleated myotube. This nascent myotube undergoes further maturation and growth, which requires the addition of nuclei by fusion of more mononucleated myoblasts with myotubes. Valerie Horsley, Grace Pavlath, and colleagues (Emory University, Atlanta, Georgia) have found that nascent myotubes promote fusion, and thus their own growth, by secreting a cytokine normally associated with immune cells.The cross-system cytokine is IL-4, which is required in immune cells for macrophage fusion. Not one to throw away a good thing, Nature evidently coopted the system for muscle cells. As in immune cells, IL-4 expression in nascent myotubes is driven by a member of the NFAT transcription factor family. Myotubes lacking either IL-4 or the NFAT factor were smaller and had fewer nuclei than wild-type cells. Recovery from muscle injury was also diminished by the lack of IL-4 or the IL4alfa receptor.Myoblasts are the targets of IL-4 action, which may promote fusion by inducing myoblast expression of adhesion molecules such as integrins (as in macrophages) or VCAM. Alternatively, IL-4 may act as a chemokine, as it does for osteoblasts, to stimulate migration of myoblasts toward myotubes. Whatever the mechanism, stem cell therapies for disorders such as muscular dystrophies may be improved by expression of IL-4 to increase the fusion capacity of the muscle stem cells. 

Alemanha e Canadá -  o sucesso da terapia gênica depende da expressão do gene no músculo pela vida toda. Há ainda muitas dificuldades na busca do agente ideal para este tratamento. Este grupo de pesquisa conseguiu melhorar os resultados da terapia gênica utilizando uma molécula promotora em conjunto com o gene da distrofina. Os resultados foram melhores inclusive em ratos com maior idade. Apesar disto poucos resultados foram observados no coração, no diafragma e em outros músculos. 

Expression of Dystrophin Driven by the 1.35-kb MCK Promoter Ameliorates Muscular Dystrophy in Fast, but Not in Slow Muscles of Transgenic Mdx Mice NEW

MOLECULAR THERAPY Vol. 8, No. 1, July 2003

Patrick Dunant,1 Nancy Larochelle,1,2 Christian Thirion,1 Rolf Stucka,1 Daniel Ursu,3 Basil J. Petrof,4 Eckhard Wolf,1 and Hanns Lochmu¨ller1,*

 E-mail: [email protected]

Successful gene therapy of Duchenne muscular dystrophy may require the lifelong expression of a therapeutic gene in all affected muscles. The most promising gene delivery vehicles, viral vectors, suffer from several limitations, including immunogenicity, loss of therapeutic gene expression, and a limited packaging capacity. Therefore, various efforts were previously undertaken to use small therapeutic genes and to place them under the control of a strong and muscle-specific promoter. Here we report the effects of a minidystrophin (6.3 kb) under the control of a short muscle-specific promoter (MCK 1.35 kb) over most of the lifetime (4–20 months) of a transgenic mouse model. Dystrophin expression remained stable and musclespecific at all ages. The dystrophic phenotype was greatly ameliorated and, most importantly, muscle function in limb muscles was significantly improved not only in young adult but also in aged mice compared to nontransgenic littermates. Dystrophin expression was strong in fasttwitch skeletal muscles such as tibialis anterior and extensor digitorum longus, but weak or absent in heart, diaphragm, and slow-twitch muscles. Additionally, expression was strong in glycolytic but weak in oxidative fibers of fast-twitch muscles. This study may have important implications for the design of future gene therapy trials for muscular dystrophy.

http://www.ananova.com/news/story/sm_797512.html

Inglaterra - neste trabalho divulgado hoje os pesquisadores ingleses utilizando oligonucleotídeos numa técnica conhecida como antisense conseguiram excelentes resultados.  Os oligonucleotídeos foram transferidos em grande porcentagem para a célula com a utilização de um detergente sintético. A força muscular aumentou para 70% do normal por mais de três meses. Apesar do excelente resultado há um grande caminho até a utilização desta técnica em seres humanos. 

Mais links para este artigo:

RESEARCHERS REMOVE GENE DEFECT IN COMMON FORM OF MUSCULAR DYSTROPHY 

Functional amounts of dystrophin produced by skipping the mutated exon in the mdx dystrophic mouse

USA - Pesquisadores tinham com objetivo entender o papel da alteração dos vasos no aparecimento de lesão cardíaca em um modelo em camundongos com deficiência de beta ou delta sarcoglican (distrofia tipo cinturas experimental). Neste estudo eles conseguiram demonstrar que as alterações nos vasos não são responsáveis pelas alterações cardíacas. Além disso eles observaram que a injeção do vetor viral contendo o gene que faltava ao músculo produzia recuperação do músculo cardíaco. Eles concluem que o uso de técnicas de terapia gênica aliadas a medicamentos de proteção do músculo cardíaco pode ser uma estratégia promissora na distrofia tipo cinturas

Novo link: Cell Therapy of {alpha}-Sarcoglycan Null Dystrophic Mice Through Intra-Arterial Delivery of Mesoangioblasts.

Outros links:

Stem Cells Offer Hope for Muscular Dystrophy 

Modified Blood Vessel Stem Cells Might Treat Muscular Dystrophy 

STEM CELLS WORK AGAINST MUSCULAR DYSTROPHY IN MICE,
MDA SCIENTISTS FIND

Itália - estudo realizado em camundongos demonstra o potencial das células tronco retirada de vasos sanguíneos no tratamento da distrofia muscular. Apesar de ser um estudo ainda inicial, eles demonstraram ser possível obter células adultas dos vasos, os mesangioblastos, corrigirem estas células em laboratório e infundí-las novamente em camundongos. O modelo utilizado foi da deficiência do gene da alfa sarcoglican, uma forma de distrofia muscular tipo cinturas. As células tratadas e reinfundidas na circulação ajudaram na produção de células musculares sadias. Como são células retiradas do próprio organismo a possibilidade de rejeição é menor.

Japão - o IGF-1 tem sido testado em distrofia muscular há algum tempo. Neste estudo experimental foram realizadas lesões musculares em camundongos e a o IgF-1 foi transferido ao músculo por corrente elétrica. Os pesquisadores demonstraram que o IGF-1 promove regeneração dos músculos. Este trabalho demonstra o potencial do IGF-1 na regeneração muscular e é uma alternativa para o tratamento da distrofia muscular.

IGF-I gene transfer by electroporation promotes regeneration in a muscle injury model  

Gene Therapy. 10(8):612-620, April 2003.

Takahashi, T 1; Ishida, K 1; Itoh, K 1; Konishi, Y 2; Yagyu, K-I 2; Tominaga, A 2,3; Miyazaki, J-I 4; Yamamoto, H 1

The goal of this study was to determine whether insulin-like growth factor-I (IGF-I) gene delivery by electroporation promotes repair after muscle injury. An injury-repair model was created using mice in which a hamstring muscle was cut and sutured. A total of 50 [mu]g of IGF-I DNA or green fluorescent protein (GFP) DNA (both in pCAGGS) was injected into the lesion and introduced into muscle cells by electrostimulation using an electric pulse generator. The number of regenerating muscle fibers in the IGF-I DNA group was significantly more than that in the GFP DNA group at 2 weeks after injection. The diameter of regenerating muscle fibers from the IGF-I DNA group was larger than that of the GFP DNA group at 4 weeks after injection. There was no significant difference in the serum IGF-I concentration between the IGF-I DNA group and the GFP DNA group at 1, 2, and 4 weeks after injection. However, muscle IGF-I concentration in the IGF-I DNA injection group was significantly greater than that in the GFP DNA injection group at 2 weeks after injection. These results demonstrated that the effects of enhanced IGF-I production were local and limited to the injected area. The ratio (injected/uninjected; intact) of the amplitude of compound muscle action potentials (CMAP) in the IGF-I DNA injection group was greater than that in the GFP DNA injection group at 4 weeks after injection and of the control group. In conclusion, IGF-I gene transfer by electroporation proved to be a simple, safe, inexpensive, and effective method to promote the regeneration of injured muscles in our injury model.

Itália - o uso de mioblastos para terapia gênica esbarra na dificuldade da célula migrar para o músculo. Pesquisadores italianos associados a equipe canadense identificar um subtipo de células tronco de origem muscular com baixa ligação aos vasos sanguíneos; estas células tem maior potencial para utilização em terapia gênica.

Dinamarca - em trabalhos anteriores a ADAM 12 reduziu as alterações patológicas da distrofia muscular. Há redução da necrose muscular e redução dos níveis de enzima CPK. Neste trabalho os pesquisadores conseguiram aumentar os níveis de utrofina, alfa 7 integrina e outras glicoproteínas em camundongos. Este resultado evidencia que o uso da ADAM 12 é uma alternativa ao uso da distrofina na terapia gênica da distrofia muscular. 

USA - este estudo foi realizado em camundongos submetidos a lesão muscular (não eram camundongos com distrofia muscular). Eles observaram melhora da recuperação dos músculos utilizando terapia combinada com IGF-1, fator que aumenta a regeneração muscular e decorin, droga que bloqueia a fibrose dos músculos. Como a regeneração muscular esta prejudicada na distrofia muscular de Duchenne e a há um aumento da fibrose esta terapia pode ter sucesso nesta doença. A associação de IGF-1 e decorin ainda não foi testada na distrofia muscular experimental.

Austrália -  uma das formas de terapia gênica é tentar corrigir o gene defeituoso com oligonucleotídeos; seria uma forma de terapia gênica mais fácil e poderia ser útil para 70% dos pacientes. Neste estudo eles utilizaram camundongos adultos (o que simula a situação atual desta geração de pacientes com distrofia).  Após a injeção intramuscular dos oligonucleotídeos, 20 a 30% dos músculos expressaram a distrofina. Apesar da expressão ter sido transitória o efeito seria suficiente para melhorar os sintomas (ou seja seria possível transformar uam distrofia de Duchenne numa forma mais branda como a de Becker). Esta é uma pesquisa bastante promissora mais ainda longe de testes em seres humanos.

Enhanced in vivo delivery of antisense oligonucleotides to restore dystrophin expression in adult mdx mouse muscle. 

K.E. Wells;, S. Fletcher, C.J. Mann, S.D. Wilton, D.J. Wells - Australia

FEBS Letters 27592 (2003):1-5

Abstract: The use of antisense oligonucleotides (AOs) to induce  exon skipping leading to generation of an in-frame dystrophin protein product could be of benefit in around 70% of Duchenne muscular dystrophy patients. We describe the use of hyaluronidase enhanced electrotransfer to deliver uncomplexed 2P-O- methyl modified phosphorothioate AO to adult dystrophic mouse muscle, resulting in dystrophin expression in 20-30% of fibres in tibialis anterior muscle after a single injection. Although expression was transient, many of the corrected fibres initially showed levels of dystrophin expression well above the 20% of endogenous previously shown to be necessary for phenotypic correction of the dystrophic phenotype.

USA - as manifestações cardiacas nas diferentes formas de distrofia muscular são frequentes (mais de 90% na distrofia muscular de Duchenne). Nesta pesquisa foi utilizada uma forma reduzida da distrofina que já tinha demonstrado efeito nos músculos dos membros. O vírus contendo o microgene foi injetado na cavidade do coração. Após 10 meses os resultados demonstrarm um aumento significativo de fibras expressando a distrofina mas o que é mais importante a restauração do complexo proteico da membrana da célula demonstrando  que a integridade da célula tinha sido recuperada. Este trabalho demonstra ser viável o uso da terapia gênica para tratamento das manifestações cardíacas da distrofia muscular.

USA - nesta revisão os autores colocam as dificuldades para a terapia gênica na distrofia muscular e relacionam as alternativas existentes como a estimulação de outros genes para corrigir as consequências da falta da distrofina. Este é um ponto que vários autores tem enfatizado: a necessidade de realizar pesquisas para retardar a evolução da doença até que a terapia gênica seja possível. 

Itália - a gentamicina é um antibiótico que já foi muito usado em medicina, mas no momento tem sido pouco utilizado por seus efeitos colaterais (surdez e tóxico para o rim) e por ser injetável. Alguns estudos tem relatado seu benefício numa forma particular de mutação da distrofia muscular de Duchenne, a mutação de ponto. Os primeiros resultados divulgados nos Estados Unidos não foram bons. Neste estudo, 4 crianças com distrofia muscular de Duchenne foram tratados com 2 ciclos de gentamicina com 7 semanas de intervalo. Três dos quatro pacientes apresentaram resultados positivos. Um dos meninos apresentou um resultado muito expressivo na expressão da distrofina, vista na biópsia muscular realizada após o tratamento. Os dois outros pacientes apresentaram expressão da distrofina nas fibras musculares e em um caso não houve nenhum resultado. Este estudo abrirá caminho para novos estudos para pesquisar quais os pacientes que poderiam se beneficiar deste tratamento.

China - pesquisadores chineses construiram um vírus com um minigene humano da distrofina. Este vírus foi injetado em camundongos portadores de distrofia. Os camundongos tratados apresentaram expressão da distrofina com restauração da membrana muscular. Só temos o resumo do artigo que foi publicado em chinês.

Holanda -  neste artigo os autores fazem uma revisão de todas as linhas de pesquisa em distrofia muscular, analisando as probabilidades de sucesso em cada uma delas. Apesar de não trazer novidades o artigo permite entender melhor as formas de terapia gênica atualmente pesquisadas. O artigo está disponível na versão integral em pdf aqui. 

USA - O Encontro Anual da Sociedade de Neurociências será realizado de 8 a 12 de novembro de 2003, em New Orleans. Deste encontro selecionei três artigos relacionados com a distropia muscular: o mais importante é relacionado com a terapia gênica e foi realizado na China. Neste estudo os camundongos com distrofia muscular foram submetidos a transplante de células tronco da medula óssea. Os animais foram submetidos a radioterapia antes do tratamento. Após três meses do tratamento 10% dos animais apresentavam expressão da distrofina. Houve melhora da força muscular nos animais tratados e aumento da sobrevida em relação aos animais do grupo controle. No segundo artigo os autores demonstraram o aumento da expressão do receptor da transferrina em fibras de regeneração em pacientes com distrofia muscular. Este receptor esta relacionado a entrada do ferro e pode indicar um papel deste elemento no retardo da deterioração muscular. O terceiro artigo estuda o efeito dos corticóides na distrofia muscular experimental, tentando entender como esta droga atua.

1) C. Zhang, S. Chen, Y. Xie, W. Huang, S. Li, W. Zhang, Q. Li, X. Liu. THERAPEUTIC EFFECT OF DUCHENNE MUSCULAR DYSTROPHY MICE WITH BONE MARROW STEM CELLS TRANSPLANTATION. Program No. 413.9. 2003

Objective: To investigate the locomotive function, electronic physiology changes, and expression of dystrophin in Duchenne muscular dystrophy mice(mdx and dko) with bone marrow stem cells transplantation.
Methods: The bone marrow stem cells of C57BL/6 4-to-5 weeks age were isolated and cultured in vitro for 3 days, then the stem cells about 5.0X106 injected intravenously into the mdx mice and dko mic 7-to-8 weeks age , respectively. Before injecting, 10 mdx mice and 10 dko mice were preconditioned with 7 Gy gamma ray to decrease the immune reaction. The clinical features of the graft verse host disease (GVHD). in the transplanted mice were assessed and investigated after bone marrow stem cell transplatation..12 weeks after being transplanted, the locomotion function, muscle electrophysiologic features(EMG) and dystrophin expression of the mdx mice and dko mice were investigated..
Results: Three month after bone marrow stem cells transplanting, we find that (1) there were more than 10% of muscle cells expression dystrophin protein in each transplanted mice(mdx and dko); (2) the electromyography showed almost normal waves in the transplantation mdx mice and dko mice; (3)the locomotive function improved obviously in transplantation dko mice; (4)the life span of the transplantation dko mice were more than 200 days( the life span of control of dko mice were less than 140 days).
Conclusions: Allogenic bone marrow stem cells transplantation can improve the electromyographic items, dystrophin expression in muscles of mdx and dko mice. Further more, the stem cell transplantation can improve the locomotive function and prolong the life span of dko mice.

2) Y. Zhu, B. Chen, H. Gong, J. Pan, W. Zhang. EXPRESSION OF TRANSFERRIN RECEPTOR IN DUCHENNE MUSCULAR DYSTROPHY TISSUES. Program No. 80.2. 2003

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is an X-linked, fatal disease caused by mutations of the gene encoding the cytoskeletal protein dystrophin. Skeletal muscle of DMD patients is characterized by an ongoing process of degeneration and regeneration. Transferrin receptor (TfR, CD71), an integral membrane glycoprotein, mediates cellular uptake of iron. In most tissues, TfR expression is correlated positively with proliferation and regulated at the post-transcriptional level. To determine if TfR is involved in muscular regeneration in DMD patients, we examined the expression of TfR in muscle samples of 42 patients with DMD, and 10 from normal volunteers. Immunohistochemical staining of TfR was positive with variable intensity in normal control and DMD patients. In normal control, TfR was faintly expressed on the surface of muscle fibers. In DMD patients, strong TfR reaction was detected. In some muscular fibers from DMD patients, TfR was found strongly expressed inside the fibers. Further detection with Enzyme histochemistry and acridine orange (AO) fluorescence techniques showed that these fibers with strong TfR expression were regenerative IIc type fibers. The increase of TfR expression in regenerative fibers suggests that the high uptake of iron may promote the capacity of muscle regeneration and thus may delay the deterioration of DMD patients.

3) C.G. Carlson. STEADY STATE CALCIUM AND RESTING CALCIUM INFLUX IN NONDYSTROPHIC AND MDX MYOTUBES EXPOSED TO PREDNISONE OR PREDNISOLONE. Program No. 413.10. 2003

Certain glucorticoids, such as prednisone, prednisolone and deflazacort, increase muscle strength and slow the progress of Duchenne muscular dystrophy (Fenichel et al., Neurology, 41, 1874, 1991) by one or more mechanisms that have not yet been fully characterized. Evidence from 45calcium uptake studies in the C2C12 muscle cell line suggests that one mechanism may involve decreases in calcium influx following one or more days of exposure to these agents beginning at the period of myoblast fusion (Passaquin et al., Brit. J. of Pharmacol., 1998). Recent evidence from this laboratory obtained in FURA-loaded cultured lens epithelial cells indicates that some steroids, however, may induce very rapid (seconds to minutes) effects on resting calcium influx measured by the manganese quench technique (Samadi et al., Pfluegers Arch. Europ. J. Physiol.,444, 700-709, 2002). To determine whether glucorticoids exert a unique action on resting calcium influx in dystrophic muscle, studies have begun to characterize any acute, nongenomic effects of prednisone or prednisolone on steady state calcium levels and resting calcium influx in cultured nondystrophic and mdx myotubes. Initial results indicate that neither prednisone (10 microM, 100 microM) nor prednisolone (100 microM) has immediate effects on steady state calcium levels in nondystrophic myotubes, but that prednisolone may induce a slight decrease in manganese quench rate in mdx myotubes at relatively early stages in culture (culture day 12-14). These results further demonstrate the utility of the manganese quench technique in assessing whether short or long term exposure to glucorticoids induces a beneficial reduction in resting calcium influx in dystrophic skeletal muscle.

França - pacientes com deficiência imunológica de causa genética tem sido submetidos a terapia gênica com sucesso. No entanto há 2 anos casos de leucemia forma descritos nos pacientes submetidos a terapia gênica. Neste estudo atual os pesquisadores identificaram o gene que foi "ligado" e desencadeou a leucemia:LMO2. Este é um efeito colateral que pode ocorrer com a manipulação dos genes. As crianças com leucemia foram tratadas com quimioterapia e transplante de medula e encontram-se em remissão da leucemia e em boas codições de saúde.

USA - a terapia gênica que tem sido muito testada em cães e camundongos ainda tem sérios problemas a serem resolvidos. Um deles é fazer com que a gene entregue até o músculo continue funcionando em muitas células musculares e definitivamente. Neste experimento que não utilizou o gene da distrofia, eles introduziram no músculo de camundongo um gene da luciferase que faz a céula produzir uma proteína luminosa, fácil de ser identificada. Após algum tempo a célula para de emitir luz, indicando que o gene parou de funcionar. Utilizando em conjunto com o gene da luciferase um outro gene, o da integrase, o músculo continuou a emitir luz prolongadamente, indicando que o gene se integrou à célula. É um trabalho interessante mas ainda muito inicial. Apesar do título da reportagem que fala em cura da distrofia com esta técnica serão precisos muito mais experimentos em camundongos e muitos outros em cães para poder iniciar os testes em humanos. Apesar da notícia estar bem explicada a manchete é muito sensacionalista.

USA - no músculo existem células satélites, precursoras das células musculares com capacidade semelhante a das células tronco; neste estudo em camundongos os pesquisadores utilizaram um vetor viral que levou o minigene da distrofina a estes células precursoras que tiveram o seu defeito genético corrigido. Estas células "tratadas" conseguiram levar o gene da distrofina ao músculo, corrigindo o defeito genético.

USA - neste estudo os pesquisadores corrigiram as células tronco de origem muscular e injetaram em camundongos portadores de distrofia. Houve um resultado positivo desta terapia mas após algumas semanas do experimento houve uma resposta inflamatória no músculo demonstrando mais uma vez que será necesário utilizar um tratamento imunossupressor quando a terapia gênica estiver disponível.

USA - a entrada de cálcio no músculo com distrofia muscular contribui para o agravamento da lesão muscular. Este é um dos mecanismos de agressão muscular na distrofia. Nesta pesquisa os autores demonstraram que com a terapia gênica em camundongos o fluxo de cálcio no músculo se restabelece, indicando que a terapia gênica pode contribuir para corrigir o defeito genêtico e bloquear um dos mecanismos de agressão dos músculos.

Inglaterra - a utrofina A pode substituir a distrofina em pacientes com distrofia muscular. O aumento desta proteína pode compensar a deficiência de distrofina. Neste estudo os autores demonstraram que o aumento da utrofina ocorre independente de haver regeneração no músculo. O objetivo é identificar drogas que possam estimular este aumento da utrofina. O resumo deste artigo que será publicado em breve na revista Neuromuscular Disorders segue abaixo:

A-utrophin up-regulation in mdx skeletal muscle is independent of regeneration NEW

Andrew P. Weir, Jennifer E. Morgan, Kay E. Davies

Abstract

Duchenne muscular dystrophy is a fatal childhood disease caused by mutations that abolish the expression of dystrophin in muscle. Utrophin is a paralogue of dystrophin and can functionally replace it in skeletal muscle. A method to induce utrophin up-regulation in muscle should therefore be therapeutically useful in Duchenne muscular dystrophy. The search for such a method needs to be informed by an understanding of the mechanisms controlling utrophin expression in muscle. Two full length utrophin isoforms are expressed: A and B. A-utrophin is up-regulated in dystrophin deficient skeletal muscle and we sought to test the hypothesis that this up-regulation occurs as a consequence of ongoing regeneration. We measured utrophin expression by immunohistochemistry and immunoblotting in the oesophageal outer muscular layer and in g-irradiated limb muscle from mdx mice. Skeletal muscle in these tissues is dystrophin deficient but not regenerating; we found that A-utrophin up-regulation still occurred. We conclude that utrophin up-regulation in skeletal muscle does not depend on regeneration. An alternative hypothesis involving competition for binding sites between utrophin and dystrophin is discussed. These results have important implications for future studies aiming to effect therapeutic utrophin up-regulation in Duchenne muscular dystrophy patients.

Japão - um professor da Universidade de Kobe anunciou hoje que um paciente de 10 anos com distrofia muscular de Duchenne foi submetido a terapia gênica com oligonucleotídeos. O paciente recebeu um trecho de DNA para corrigir o DNA defeituoso do paciente. Após este tratamento ele conseguiu demonstrar que o paciente apresenta o RNA mensageiro, intermediário entre o DNA e a síntese de distrofina. Ele acredita que a distrofina certamente será formada apesar deste resultado ainda não estar pronto (demorará alguns meses). Esta técnica permitirá a melhora dos sintomas da distrofia mas não será a cura. Acreditá-se que está forma de tratamento poderá transformar a distrofia muscular de Duchenne em distrofia muscular de Becker. Ainda é um resultado muito inicial (paciente recebeu o tratamento há menos de 2 meses e não há grandes detalhes do procedimento mas é a primeira etapa em seres humanos para tornar esta forma de tratamento viável.

USA - a Napro, empresa de biotecnologia foi escolhida pelo Instituto Nacional de Saúde americano para receber uma verba para realizar pesquisas em camundongos e cachorros para corrigir a distrofia muscular através de técnicas de terapia gênica.

Japão - em 3/12/03 relatamos o primeiro caso de terapia gênica com oligonucleotídeos, realizado em Kobi no Japão. Esta semana dois pais americanos entraram em contato com o Dr. Masafumi Matsuo que informou que a técnica que ele está desenvolvendo, para transformar a distrofia de Duchenne em Becker,  pode ser utilizada na deleção do exon 20 ou 20+. Ele se colocou a disposição para realizar este tratamento em pacientes de outros países. Para qualquer contato o e-mail do Dr. Matsuo é: [email protected] . Ele tem um artigo que descreve as bases técnicas desta terapia, utilizada inicialmente em camundongos. Você pode ler o artigo aqui.

Holanda - há cerca de uma semana informamos que um pesquisador japonês iniciou uma forma de terapia gênica em pacientes com distrofia muscular de Duchenne. A limitação desta técnica é que ela só é útil para portadores de deleção do exon 20 e 20+. Neste trabalho em laboratório, utilizando células de pacientes com distrofia muscular os pesquisadores realizaram  um aperfeiçoamento desta técnica de oligonucleotídeos que pode permitir o tratamento independente do local da deleção. 

 

Rússia -  nesta semana tivemos acesso a 3 resumos (copiados abaixo) de artigos publicados na Rússia a cerca da distrofia muscular. No primeiro os pesquisadores estudaram células musculares com mutação de ponto (uma forma de mutação que atinge 10 a 15% dos portadores de distrofia muscular de Duchenne) e observaram que a supressão do gene tRNA pode promover a produção de distrofina. Estudando esta técnica em camundongos com distrofia eles observaram um resultado positivo em 2,5% das fibras. É um resultado muito discreto mas esta técnica precisa ser melhor estudada. No segundo artigo eles fazem uma revisão das técnicas de terapia gênica que estão sendo estudadas na Rússia. No terceiro artigo os pesquisadores relatam a técnica de transplante de mioblastos no músculo da perna de 4 pacientes com distrofia muscular de Duchenne; em três ele constatou a presença de distrofina; neste terceiro artigo não existem informações sobre a técnica utilizada e se os pacientes fizeram uso de imunossupressores.

13/01/04: Suppression of Nonsense Mutations in the Dystrophin Gene by a Suppressor tRNA Gene NEW 

Kiselev, A. V.; Ostapenko, O. V.; Rogozhkina, E. V.; Kholod, N. S. ; Seit-nebi, A. S. ; Baranov, A. N.; Lesina, E. A.; Ivashchenko, T. E.; Sabetskii, V. A.; Shavlovskii, M. M. ; Rechinsky, V. O. ; Kisselev, L. L. ; Baranov, V. S. - from Russia

Molecular Biology. 36(1):30-33, January/February 2002

Nonsense mutations in the dystrophin gene are the cause of Duchenne muscular dystrophy (DMD) in 10-15% of patients. In such an event, one approach to gene therapy for DMD is the use of suppressor tRNAs to overcome the premature termination of translation of the mutant mRNA. We have carried out cotransfection of the HeLa cell culture with constructs containing a suptRNA gene (pcDNA3suptRNA) and a marker LacZ gene (pNTLacZhis) using their polymer VSST-525 complexes. It was found that the number of cells producing [beta]-galactosidase depends inversely on the dose of the suptRNA gene. A single in vivo injection of the construct providing for expression of the suptRNAochre gene into mdx mouse muscle resulted in the production of dystrophin in 2.5% of fibers. This suggests that suppressor tRNAs are applicable in gene therapy for hereditary diseases caused by nonsense mutations

13/01/04: The Current State and Prospects of the Gene Therapy of Duchenne Muscular Dystrophy Worldwide and in Russia NEW 

Baranov, V. S. ; Baranov, A. N. ; Zelenin, A. V. from Russia

Russian Journal of Genetics. 37(8):868-875, August 2001

Failure of drug therapy of Duchenne muscular dystrophy (DMD) stimulated intense search for adequate methods of gene therapy (GT) which would ensure effective delivery of the dystrophin (D) gene, its long-term persistence in transfected cells, and its expression in muscle fibers. The main results of the experimental GT of DMD with the use of viral and nonviral delivery of the D gene into muscles of biological models are discussed. Delivery of a mini-gene of D with a specific muscle promoter using a modified adenoassociated virus is currently the most promising method, which will soon be available for clinical trials. The main results of the studies on the DMD GT in Russia are summarized. The results of experiments on genetic transfection of mdx mice with marker genes and various constructions with the D gene are outlined. The genes are delivered into muscles by means of gene gun, electroporation, viral oligopeptides, liposomes, microspheres, lactoferine, and other nonviral vehicles. It is emphasized that consolidation of funds and efforts of all Russian laboratories dealing with gene and cell therapy of DMD are necessary to complete the experiments and start clinical trials.

13/01/04: Expression of Dystrophin in Duchenne Muscular Dystrophy Patients after Myoblast Transplantation NEW 

Shishkin, S. S.; Terekhov, S. M.; Krokhina, T. B.; Shakhovskaya, N. I.; Podobedova, A. N.; Lyannaya, G. F. ; Tarasov, V. I.; Ovchinnikov, V. I.; Krakhmaleva, I. N.; Zakharov, S. F.; Ershova, E. S.; Limborska, S. A.; Pogoda, T. V.; Zotikov, E. A.; Kut'ina, P. M.; Tarksh, M. A.; Sukhorukov, V. S.; Gerasimova, N. L.  from Russia

Based on originally designed technique of myoblast cultivation and in accordance with the approved by the Russian Ministry of Health "one muscle treatment" protocol of myoblast transplantation to the Duchenne muscular dystrophy patients, the first in Russia clinical trial of this gene correction method was carried out. Immunologically related myoblast cultures (30 to 90 million cells per patient) were injected after all preliminary procedures into tibialis anterior muscles of four boys selected from a group of volunteer recipients (Duchenne muscular dystrophy patients) based on the analysis of a number of surface antigens in donor-recipient pairs. The condition of the patients remained satisfactory during the whole period of post-transplantation follow-up (from 6 months to 1.5 years). Six months after myoblast transplantation the presence of donor DNA or dystrophin synthesis was demonstrated in muscle biopsies of three out of four patients. This result confirms efficacy and safety of the procedure used.

USA - John Wolff do Departamento de Pediatria da Universidade de Wisconsin pretende utilizar uma forma de terapia gênica que não utiliza vetores virais para levar o gene até o músculo. Ele pretende utilizar uma forma de terapia semelhante ao grupo francês que realizou as primeiras pesquisas em 2003. As pesquisas se iniciarão em 2004

França - os trabalhos clínicos com o uso de gentamicina na mutação de ponto na Distrofia Muscular de Duchenne mostram resultados muito variáveis. Neste artigo os pesquisadores estudaram a resposta a gentamicina na mutação de ponto e concluiram:a resposta in vivo é semelhante a resposta in vitro; que a resposta  é variável, dependendo da mutação testada; não há como prever esta resposta; uma pequena porcentagem responde a gentamicina. Eles concluem que o estudo in vivo, caso a caso, permitirá identificar os candidatos a esta forma de terapia.

Canadá - este grupo de pesquisadores avaliou os resultados tardios obtidos com a terapia gênica em camundongos com distrofia muscular.  Após um ano do tratamento os camundongos apresentaram ainda expressão da distrofina e aumento da força muscular. Os camundongos desenvolveram reação imunológica a proteína distrofina que não impediu a melhora das alterações musculares.

USA - para que o resultado da terapia gênica seja eficiente há necessidade de que pelo menos 20% das células expressem o gene administrado. A entrega do gene ao músculo é uma das maiores dificuldades para a eficiência da terapia gênica. Utilizando um processo mal explicado (dito semisintético) eles injetaram um trecho do DNA contento o gene da distrofina na veia ou artéria de camundongos portadores de distrofia. Com esta técnica eles observaram que a distrofina se expressou nos músculos de ambas as pernas após este tratamento, demonstrando que este é um método promissor de entrega do gene ao músculo.

Inglaterra -  um dos problemas da terapia gênica é a resposta que os músculos tem à expressão da distrofina, que é considerada estranha ao músculo. No modelo experimental os pesquisadores conseguiram fazer o músculo expressar a distrofina humana prolongadamente sem grande resposta inflamatória.

USA - recentemente células precursoras foram identificadas nos músculos com um potencial que se assemelha as células tronco. Neste estudo, liderado por Louis M Kunkel, descobridor do gene da distrofina, as células precursoras musculares de camundongos com distrofia foram retiradas do músculo e receberam o microgene da distrofina. O microgene foi introduzido na células por um vetor viral. Este microgene consegue fazer a célula produzir distrofina. Estas células precursoras tratadas foram injetadas em  veias dos mesmos camundongos e migraram para os músculos doentes. Esta é uma boa alternativa para a terapia gênica por utilizar as células precursoras do animal doente, diminuindo a change de rejeição às células e a resposta inflamatória do músculo.

USA - recentemente eu tenho incluído vários artigos sobre o uso da gentamicina em distrofia muscular e em outras doenças genéticas. Este trabalho foi realizado por um grupo que há muito tempo tem estudado o uso desta droga.  Neste estudo além da gentamicina eles estudaram outras drogas do mesmo grupo com a amicacina, tobramicina etc. Os autores obervaram uma resposta bastante variada, dependendo da localização da mutação de ponto. Este é um grupo de drogas que precisa ser melhor estudado, inclusive para determinar quem poderia ser beneficiado por este tratamento.

USA - usando um modelo experimental da doença de Pompe, camundongos foram submetidos a terapia gênica no músculo diafragma. Para levar o gene ao músculo os pesquisadores utilizaram um gel comum. Os animais tratados apresentaram recuperação da função respiratória com este tratamento; esta tecnica pode ser testada em outros modelos e em outras formas de distrofia.

França - o controle da entrada do cálcio e sua liberação na célula é um dos pontos aceitos como responsáveis pela lesão dos músculos na distrofia muscular. Neste artigo, escrito pelo grupo francês que realizou as primeiras pesquisas em terapia gênica em pacientes, os autores estudaram em laboratório células de pacientes com distrofia muscular que foram submetidas a terapia gênica com mini gene ou gene inteiro da distrofina. O tratamento resultou em melhor controle do cálcio das células musculares. Isto indica que a distrofina tem um papel importante neste controle e que a terapia gênica pode restaurar este controle e diminuir a lesão muscular. Este artigo que será publicado na Revista Experimental Cell Research este ano tem o seguinte resumo em inglês:

Improvement of calcium handling and changes in calcium-release properties after mini- or full-length dystrophin forced expression in cultured skeletal myotubes NEW

Eric Marchand, Bruno Constantin, Haouaria Balghi, Marie-Christine Claudepierre, Anne Cantereau, Christophe Magaud, Aklesso Mouzou, Guy Raymond, Serge Braun, and Christian Cognard - FRANCE

Abstract

Dystrophin is a cytoskeletal protein normally expressed underneath the sarcolemma of muscle fibers. The lack of dystrophin in Duchenne muscular Dystrophy (DMD) muscles results in fiber necrosis, which was proposed to be mediated by chronic calcium mishandling. The extensive comparison of dystrophic cells from human or mdx mice with normal muscles have suggested that the lack of dystrophin may alter the resting calcium permeability and steady-state levels of calcium, but this latter observation remains controversial. It is also not clear, whether calcium mishandling is resulting from the dystrophic process or if dystrophin can directly regulate calcium handling in muscle cells.This prompted us to determine if transfection of full-length dystrophin or Becker Muscular Dystrophy (BMD) minidystrophin, a candidate for viral-mediated gene therapy, could change calcium handling properties. We took advantage of specific properties of Sol8 cell line showing the absence of dystrophin expression together with a drastic calcium mishandling. Here, we show that full-length dystrophin allowed the recovery of a low resting intracellular-free calcium concentration together with lower calcium transients. We also show for the first time that stable expression of minidystrophin was able to restore normal calcium handling in Sol8 myotubes through a better control of steady-state levels, calcium transients, and subcellular calcium events. It suggests that dystrophin could play a regulatory role on calcium homeostasis apparatus and that functional links exist between calcium signaling and cytoskeleton.

USA - no Encontro que reunirá os principais pesquisadores na área de terapia gênica serão apresentados 20 artigos que falam sobre esta forma de tratamento na distrofia muscular; a maioria é experimental, em camundongos ou cães, e não trazem nenhum avanço significativo. O único trabalho em humanos (artigo 7) fala do uso de mioblastos na distrofia muscular, trabalho realizado no Canadá, e que já foi divulgado aqui mais de uma vez (estão ainda com poucos crianças com distrofia muscular de Duchenne e o tratamento está sendo realizado em apenas um músculo). Os resumos em inglês dos artigos pode ser lido aqui.

Inglaterra - neste estudo os pesquisadores estudaram a terapia gênica realizada no período intrauterino, com o objetivo de curar ou retardar a evolução da doença. Utilizando um vetor viral o gene da distrofina foi administrado no 15o dia de gestação de camundongos. Após 15 meses do nascimento a expressão do gene foi observada em vários músculos como o cardíaco, diafragma, músculos intercostais, etc. Em se confirmando o sucesso desta terapia pode se constituir em uma alternativa de terapia no caso do diagnóstico da doença durante a gestação.

Canadá - o uso de mioblastos no tratamento da distrofia muscular tem sido tentado de longa data; este grupo do Canadá tem estudado minuciosamente a técnica com o objetivo de melhora-la; neste trabalho eles aqueceram as células antes do tratamento e observaram melhores resultados em laborátorio, com maior sobrevida do mioblasto. O resumo doartigo pode ser lido a seguir:

18/05/04: Myoblast survival enhancement and transplantation success improvement by Heat-Shock treatment in mdx mice NEW

Bouchentouf, Manaf; Benabdallah, Basma F.; Tremblay, Jacques P.

Transplantation. 77(9):1349-1356, May 15, 2004

Abstract

Background. Duchenne muscular dystrophy is a disease caused by the incapacity to synthesize dystrophin, which is implicated in the maintenance of the sarcolemma integrity. Myoblast transplantation is a potential treatment of this disease. However, most of the transplanted cells die very rapidly after their injection. Heat-shock proteins (HSPs) are over-expressed when cells undergo various types of stresses. Our goal was thus to investigate whether the expression of HSPs (HSP70 in particular) could protect myoblasts from death after intramuscular injection.
Methods. HSP70 expression was induced by warming the cells at 42[degrees]C for 60 minutes. HSP70 over-expression was quantified by Western blot analysis. The in vitro effect of HSPs on cell survival was evaluated by fluorescence-activated cell sorter analysis using the Hoescht/propidium iodide-labeling technique, and their in vivo effects were investigated by transplanting TnI-LacZ myoblasts labeled with [methyl-14C] thymidine.
Results. Western blots indicated a sevenfold over-expression of the HSP70 after the heat-shock treatment. In vitro, the heat-shock treatment protected 18% of the cells from staurosporine- (1 [mu]M) induced apoptosis. HSPs also protected 10% of the cells from death induced by either tumor necrosis factor-[alpha] (30 ng/mL) or glucose oxydase (0.1 U/mL). In vivo, the treatment improved the cell survival by twofold 5 days after the graft and increased by fourfold the long-term graft success.
Conclusions. The heat-shock treatment is a practical approach for improving the success of myoblast transplantation; in fact, using this kind of treatment, there is no need to genetically modify the cells before their transplantation.
 

Canadá - os vírus tem sido muitos estudados com a finalidade de levar os genes até os músculos; neste experimento os genes do vírus foram totalmente retirados; este virus contendo o gene da distrofina foi administrado ao camundongo e houve a expressão do gene em 23,6% das fibras musculares do músculo diafragma; houve uma discreta resposta inflamatória e os camundongos não receberam drogas imunossupressoras.

http://ajplung.physiology.org/cgi/content/abstract/00117.2004v1?maxtoshow=&HITS=&hits=&RESULTFORMAT=1&andorexacttitle=and&andorexacttitleabs=and&fulltext=muscular+dystrophy&andorexactfulltext=and&searchid=1085442715333_24004&stored_search=&FIRSTINDEX=0&sortspec=date&fdate=5/1/2004&resourcetype=1

USA - o camundongo mdx tem o defeito genético mas não tem a perda de força muscular e nem as alterações cardíacas. Neste estudo os pesquisadores criaram um camundongo que expressa a distrofina em 50% das células; estes camundongos receberam isoproterenol que promove lesão do músculo cardíaco e observaram que os que expressavam a distrofina em 50% das células não apresentaram lesão no músculo cardíaco. Em conclusão os pesquisadores concluem que o tratamento que promova a expressão do gene em 50% das células seria suficiente para tratamento das manifestações cardíacas da distrofia muscular.

 

Alemanha - o artigo publicado esta semana descreve pela primeira vez na literatura médica o caso de um menino. filho de uma professora de educação física que apresenta mutação do gene da miostatina. A miostatina é um proteína que causa inibição do crescimento muscular. Esta criança, sem o gene da miostatina, apresenta aumento dos músculos e da força muscular. Ela consegue carregar nos braços peso muito superior ao da maioria das crianças de sua idade. Fora o aumento dos músculos esta criança não apresenta nenhum outro problema físico. Este artigo ganhou um grande destaque na imprensa com inúmeras citações, porque uma das alternativas para tratamento das distrofias musculares seria a inibição da miostatina; em camundongos a inibição da miostatina também causa aumento da força muscular. Existe um laboratório farmacêutico, o Wyeth, que tem um anticorpo monoclonal anti-miostatina que será testado em breve em meninos com distrofia muscular de Duchenne. Este será um dos temas da Conferência do Parent Project deste ano; esta conferência será realizada em Ohio no período de 8 a 11 de julho de 2004. Mais informações sobre esta conferência poderá ser obtida aqui.

Mais informações sobre o menino sem miostatina (também chamado de bebê superman):

Gene Mutation Found in Muscle Man Toddler

Super-Strong Toddler Studied For Muscle-Wasting Cure

Scientists Study 'Baby Superman'

USA - PTC124 é uma droga para administração por via oral para tratamento da mutação de ponto. Esta droga poderá  ser útil para cerca de 15% dos portadores de Distrofia Muscular de Duchenne e para cerca de 10% dos portadores de fibrose cística, além de mais de 1800 doenças genéticas distintas. A empresa produtora da droga, a PTC,  anunciou hoje que está iniciando a fase I das pesquisas com PTC 124. na fase I a droga será administrada a pessoas normais para analisar a absorção da droga e seus efeitos colaterais. Inicialmente prevista para começar no final do ano a fase I foi iniciada hoje e espera-se que a droga possa ser testada em pacientes com distrofia muscular de Duchenne no início de 2005.

USA - vários problemas dificultam o sucesso da terapia gênica na distrofia muscular: chegada do gene até o músculo, expressão prolongada e estável do gene, reação imunológica. Nesta pesquisa os autores prepararam um vírus com o gene da distrofina e com o CTLA41g. O tratamento com este vetor provocou a expressão estável e prolongada do gene da distrofina com pouca reação imunológica. A técnica de terapia gênica tem sido aperfeiçoada e esta é uma maneira de se melhorar o resultado do tratamento.

USA - a Associação Americana de Distrofia Muscular (MDA) dará US$ 1,6 milhões para a Asklepios, empresa de biotecnologia associada a Universidade da Carolina do Norte. A empresa pretende utilizar o minigene da distrofina desenvolvido pelo Dr. Xiao Xiao da Universidade de Pittsburgh. A primeira etapa será testar a segurança do procedimento antes do início dos testes em pacientes com distrofia muscular de Duchenne.

USA - todos os pesquisadores concordam que o método para levar os genes para os músculos é a maior dificuldade para a terapia gênica. Os pesquisadores descrevem um método que não utiliza vetores virais e que é considerado fácil para levar os genes para os músculos. Utilizando plasmídeos os pesquisadores obtiveram sucesso na terapia gênica experimental para os músculos dos membros. O resumo do artigo em inglês que será publicado em breve está abaixo:

( Molecular Therapy. 2004,10(2):386-398) A Facile Nonviral Method for Delivering Genes and siRNAs to Skeletal Muscle of Mammalian Limbs

James E. Hagstrom, Julia Hegge, Guofeng Zhang, Mark Noble, Vladimir Budker, David L. Lewis, Hans Herweijer and Jon A. Wolff  - USA
 

Abstract

Delivery is increasingly being recognized as the critical hurdle holding back the tremendous promise of nucleic acid-based therapies that include gene therapy and more recently siRNA-based therapeutics. While numerous candidate genes (and siRNA sequences) with therapeutic potential have been identified, their utility has not yet been realized because of inefficient and/or unsafe delivery technologies. We now describe an intravascular, nonviral methodology that enables efficient and repeatable delivery of nucleic acids to muscle cells (myofibers) throughout the limb muscles of mammals. The procedure involves the injection of naked plasmid DNA or siRNA into a distal vein of a limb that is transiently isolated by a tourniquet or blood pressure cuff. Nucleic acid delivery to myofibers is facilitated by its rapid injection in sufficient volume to enable extravasation of the nucleic acid solution into muscle tissue. High levels of transgene expression in skeletal muscle were achieved in both small and large animals with minimal toxicity. Evidence of siRNA delivery to limb muscle was also obtained. The simplicity, effectiveness, and safety of the procedure make this methodology well suited to limb muscle gene therapy applications.

Canadá - este grupo de pesquisa, liderado por Jacques P. Tremblay, tem estudado novas técnicas para aperfeiçoar o transplante de mioblastos. Neste estudo, que será publicado em breve na Revista Molecular Therapy (resumo em inglês abaixo) eles estudaram uma nova técnica para correção dos mioblastos e células tronco dos músculos para poder utilizar as próprias células do paciente neste tratamento. A possibilidade de correção das células do próprio paciente poderia contribuir para melhorar o resultado deste tipo de tratamento.

(In Press: Molecular Therapy, 2004) Nucleofection of Muscle-Derived Stem Cells and Myoblasts with C31 Integrase: Stable Expression of a Full-Length-Dystrophin Fusion Gene by Human Myoblasts NEW

Simon P. Quenneville,Pierre Chapdelaine,JoJl Rousseau, Jean Beaulieu, Nicolas J. Caron, Daniel Skuk, Philippe Mills, Eric C. Olivares, Michele P. Calos, and Jacques P. Tremblay - Canada

Ex vivo gene therapy offers a potential treatment for Duchenne muscular dystrophy by transfection of the dystrophin gene into the patient’s own myogenic precursor cells, followed by transplantation. We used nucleofection to introduce DNA plasmids coding for enhanced green fluorescent protein (eGFP) or eGFP-dystrophin fusion protein and the phage C31 integrase into myogenic cells and to integrate these genes into a limited number of sites in the genome. Using a plasmid expressing eGFP, we transfected 50% of a mouse muscle-derived stem cell line and 60% of normal human myoblasts. Co-nucleofection of a plasmid expressing the C31 integrase and an eGFP expression plasmid containing an attB sequence produced 15 times more frequent stable expression, because of site-specific integration of the transgene. Co-nucleofection of the C31 integrase plasmid and a large plasmid containing the attB sequence and the gene for an eGFP–full-length dystrophin fusion protein produced fluorescent human myoblasts that were able to form more intensely fluorescent myotubes after 1 month of culture. A nonviral approach combining nucleofection and the C31 integrase may eventually permit safe autotransplantation of genetically modified cells to patients.

USA - continuando seus estudos está equipe realizou a terapia gênica utilizando-se de um vetor não viral em camundongos com distrofia, injetando-o diretamente na artéria. Após 6 meses apenas 1-5% das miofibras expressaram a distrofina. Houve resposta imunológica a este tratamento com aparecimento de anticorpos.

Japão - este grupo de pesquisa estuda o uso de oligonucleotídeos para a terapia gênica da distrofia muscular de Duchenne; com esta técnica eles conseguem "consertar" o gene causando uma progressão mais lenta da doença. Neste trabalho eles testaram uma nova técnica de oligonucleotídeos utilizando o RNA e obtiveram sucesso em cultura de células de um portador de Distrofia Muscular de Duchenne. Este grupo já está utilizando uma outra forma de tratamento com oligonucleotídeos em alguns pacientes.

Japão - neste artigo que será publicado em breve na Revista Molecular Therapy (cujo resumo em inglês segue abaixo) os autores descrevem um experimento em camundongos com distrofia muscular que receberam o minigene da distrofina. Apesar de uma pequena quantidade de fibras expressarem a distrofina houve uma significativa melhora das alterações patológicas do músculo e aumento da força muscular.

(IN PRESS: Molecular Therapy, 2004) AAV Vector-Mediated Microdystrophin Expression in a Relatively Small Percentage of mdx Myofibers Improved the mdx Phenotype NEW

Madoka Yoshimura, Miki Sakamoto, Madoka Ikemoto, Yasushi Mochizuki, Katsutoshi Yuasa, Yuko Miyagoe-Suzuki, and Shin’ichi Takeda - Japan

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a lethal disorder of skeletal muscle caused by mutations in the dystrophin gene. Adeno-associated virus (AAV) vector-mediated gene therapy is a promising approach to the disease. Although a rod-truncated microdystrophin gene has been proven to ameliorate dystrophic phenotypes, the level of microdystrophin expression required for effective gene therapy by an AAV vector has not been determined yet. Here, we constructed a recombinant AAV type 2 vector, AAV2-MCKDCS1, expressing microdystrophin (DCS1) under the control of a muscle-specific MCK promoter and injected it into TA muscles of 10-day-old and 5-week-old mdx mice. AAV2-MCKDCS1-mediated gene transfer into 5-week-old mdx muscle resulted in extensive and long-term expression of microdystrophin and significantly improved force generation. Interestingly, 10-day-old injected muscle expressed microdystrophin in a limited number of myofibers but showed hypertrophy of microdystrophin-positive muscle fibers and considerable recovery of contractile force. Thus, we concluded that AAV2-MCKDCS1 could be a powerful tool for gene therapy of DMD.

USA - pesquisadores desenvolveram um camundongo geneticamente modificado que apresenta maior capacidade de correr do que os camundongos normais. Os camundongos apresentam uma alteração de um gene ligado ao receptor da insulina; este camundongo poderá ajudar nos estudos de drogas para obesidade, doenças lipídicas e nas distrofias musculares.  Os comentários sobre este artigo também podem ser lidos aqui.

USA - um dos problemas não plenamente solucionados da terapia gênica é a resposta imunológica. Nesta pesquisa, cujo resumo está transcrito abaixo, os autores utilizaram um vetor viral que continha o gene da distrofina e um gene inibidor da resposta imunológica. Os resultados demonstraram que a inibição da reposta imunológica promove uma expressão rolongada do gene da distrofina nos músculos.

(IN PRESS: Molecular Therapy, 2004) Sustained Muscle Expression of Dystrophin from a High-Capacity Adenoviral Vector with Systemic Gene Transfer of T Cell Costimulatory Blockade NEW

Zhilong Jiang, Gudrun Schiedner, Nico van Rooijen, Chau-Ching Liu, Stefan Kochanek, and Paula R. Clemens - USA

Adenoviral vector (Ad)-mediated gene delivery of normal, full-length dystrophin to skeletal muscle provides a promising strategy for the treatment of Duchenne muscular dystrophy (DMD). However, cellular and humoral immune responses induced by vector gene transfer limit the application of this approach. Blockade of the costimulatory interaction between naRve T cells and antigen-presenting cells has proven to be a successful means to diminish immunity induced by gene transfer. In this study we explore the potential of supplementing dystrophin gene delivery to dystrophin-deficient Dmd mouse skeletal muscle with systemic gene delivery of CTLA4Ig and CD40Ig molecules to effect costimulatory blockade. We found that systemic administration of a high-capacity Ad (HC-Ad) vector carrying murine CTLA4Ig (AdmCTLA4Ig) either alone or codelivered with an HC-Ad vector carrying murine CD40Ig (AdmCD40Ig) provided sustained expression of recombinant full-length murine dystrophin from an HC-Ad vector carrying the dystrophin cDNA (AdmDys). The level of AdmDys vector genomes remained stable in animals cotreated with systemic delivery of vectors carrying molecules to block costimulation. In addition, muscle CD4+ and CD8+ T cell infiltrates and Th1 cytokine production by splenocytes were reduced. The production of neutralizing antibody against Ad vector was significantly inhibited in mice receiving systemic codelivery of both AdmCTLA4Ig and AdmCD40Ig, but not in the mice treated with AdmCTLA4Ig alone. The results suggested that coblockade of both CD28/B7 and CD40L/CD40 costimulatory pathways is required for effective inhibition of the Ad vector-induced humoral immune response in Dmd mice, whereas blockade of CD28/B7 alone by murine CTLA4Ig would be sufficient for prolonged dystrophin expression in treated muscle.

USA - a hemofilia é uma doença genética que causa hemorragias por falta de um fator de colagulação; neste artigo os autores descrevem sucesso a longo prazo (3 anos) com a terapia gênica de cães com hemofilia que receberam por via vascular vírus contento o gene da hemofilia que se expressou nos músculos dos cães levando a correção da doença. Esta mesma técnica pode ser utilizada na distrofia muscular.

USA -  a terapia gênica o mais precoce possível poderia impedir a degeneração muscular. Neste estudo os pesquisadores demonstram um bom resultado com o uso da terapia gênica intrauterina em camundongos com distrofia muscular. A terapia gênica na fase intrauterina seria muito importante mas difícil de se realizar pela dificuldade do diagnóstico tão precoce (só se já houvessem outros casos na família seria tentado o diagnóstico tão precoce).

China - recebi esta semana um relato do primeiro caso do transplante de células tronco em Distrofia Muscular de Duchenne; o procedimento foi realizado há  92 diasem um menino de 12 anos; previamente o paciente recebeu quimioterapia para destruir a sua médula óssea; em seguida recebeu na veia as células tronco do cordão umbilical; a biópsia realizada após 76 dias revelou que algumas fibras estava expressando a distrofina. Ele apresentou uma discreta melhora de força muscular. Este é o e-mail que recebi do Dr. Cheng Zhang que realizou o procedimento:

"Dear Dr. David Feder,

Thank you for your email. Today is 92 days that the DMD boy is transplanted by umbilical cord stem cells. He is twelve years old and he cannot walk for almost three years. The umbilical cord stem cells was transfer into his vein 92 days ago. The muscle biopsy was done after 76 days of the transplantation. We find that the dystrophin staining is weak positive in some muscle cells. We are conforming that the weak positive muscle cells come from the donor. The DMD boy has a little improvement in his locomotive function, for example, he touch his nose a little better than before. Now, the DMD boy is OK, he like watch TV, and sometimes play cards with nurse. We are still waiting and observing what happen on him.

Sincerely yours,

 Cheng Zhang, MD, PhD - Professor and Chair, Department of Neurology

First Affiliated Hospital - Sun Yat-sen University - Guangzhou, Guangdong, 510080

P. R. China"

China - em resposta as minhas perguntas o Dr. Zhang disse que o transplante utilizou células de cordão umbilical obtida de doador não aparentado; havia uma compatibilidade entre doador e receptor mas o paciente esta recebendo tratamento imunossupressor em conjunto. Ele está planejando utilizar esta terapia em outros pacientes. A resposta dele pode ser lida aqui:

"Dear Dr. David Feder,

 Thank you for your email. Yes, we used a nonrelated cord blood stem cell. Because the HLA match is very well so the immune reaction is not obvious, but we still use some immunossupresor drugs now. We are preparing another boys for transplantation.

Best wishes,

Cheng Zhang"

Canadá - neste Congresso realizado em Toronto de 26 a 30 de outubro de 2004 foram apresentados apenas dois trabalhos relatando experimentos em terapia das distrofias musculares.

No primeiro trabalho realizado nos Estados Unidos os pesquisadores apresentam uma nova forma de terapia gênica em camundongos; eles associaram ao vetor viral uma proteína (fator de crescimento do endotélio vascular); com esta terapia os camundongos passaram a expressar distrofina em quantidade suficiente para reduzir os sintomas da doença. O vetor viral foi injetado em uma veia, que é um passo importante para poder tratar todos os músculos; a forma de administração do gene da distrofia muscular é um dos problemas ainda não resolvido na terapia gênica da doença.

No segundo trabalho os pesquisadores holandeses estudam os oligonucleotídeos para "consertar" o gene da distrofina. Estudando células musculares humanas em laboratório ou camundongos com distrofia muscular eles tem conseguido demonstrar que esta forma de tratamento é viável. Estes oligonucleotideos tem que ser construidos para cada forma de mutação do gene e eles tem desenvolvido vários destes oligonucleotideos para utilização em seres humanos.

Os resumos destes dois trabalhos em inglês:

1) Body-wide delivery of a microdystrophin gene via intravascular administration of rAAV6 vectors for treatment of muscular dystrophy. P. Gregorevic, M. Blankinship, J. Allen, L. Meuse, S. Abmayr, J. Han, J. Chamberlain. Senator Paul D. Wellstone Muscular Dystrophy Cooperative Research Center, Dept. of Neurology, University of Washington, Seattle, WA.

   Severe neuromuscular disorders, such as Duchenne muscular dystrophy (DMD), lead to reduced quality of life and premature mortality. Historically, genetic interventions for these diseases have been limited by an inability to achieve widespread gene transfer to the affected tissues. Here we demonstrate a method that, for the first time, enables transduction of the vast majority of both the cardiac and skeletal musculature of adult mammals via a single intravenous administration of pseudotype 6 recombinant adeno-associated virus (rAAV6) vectors. As a means to enhance gene transfer, we have determined that IV coadministration of vascular endothelium growth factor (VEGF) with rAAV6 vectors can significantly increase vector accumulation and transgene expression in striated muscles. Having established in reporter gene studies that this technique enables tolerable, high-level transgene expression, we sought to evaluate the potential of this technique for delivering a therapeutic transgene to the musculature of the mdx dystrophic mouse, a model of DMD. Using this technique, we have observed that treated mdx mice exhibit expression of microdystrophin throughout the striated musculature in a manner that is sufficient to reduce pathological features of the dystrophic phenotype. Compared with untreated mice, the muscles of treated animals exhibit reduced susceptibility to contraction-induced injury, and reduced serum creatine kinase levels, reflecting a global reduction in muscle degeneration. These data are the first to demonstrate body-wide amelioration of symptoms associated with dystrophin deficiency in an adult animal following a genetic intervention. In subsequent studies we have established that these techniques can be adapted to express alternate transgenes for the treatment of other muscle diseases. We are currently undertaking studies to determine whether the existing techniques are effective in animals more similar in size and immunology to humans, and present relevant data summarizing our progress

2) Therapeutic antisense-induced exon skipping for Duchenne muscular dystrophy. A. Aartsma-Rus1, A. Janson1, G. Platenburg2, M. Bremmer-Bout1, J.T. Den Dunnen1, J.C.T. Van Deutekom1, G-J.B. Van Ommen1. 1) LUMC, Leiden, the Netherlands; 2) Prosensa, Leiden, the Netherlands.

   The severe Duchenne muscular dystrophy (DMD) is mostly caused by frame disrupting mutations in the dystrophin gene, which result in non-functional proteins. Mutations that keep the reading frame intact give rise to internally deleted, semi-functional dystrophins and result in the milder Becker muscular dystrophy (BMD). Antisense oligonucleotides (AONs) have the potential to modulate the pre-mRNA splicing such that a specific exon is skipped. As a result, the reading frame can be restored, which allows the synthesis of a BMD-like dystrophin.
   We have recently demonstrated the skipping of 20 different human DMD exons using 2'-O-methyl RNA AONs with a full-length phosphorothioate backbone (2OMePS), and confirmed the therapeutic applicability of this strategy in cultures from 10 different DMD patients. We now compare the efficacy and efficiency of 2OMePS AONs to morpholino, locked nucleic acid (LNA) and peptide nucleic acid (PNA) AONs. While LNA was most efficient in inducing exon skipping, we find that it acts in a less sequence-specific manner, probably due to its extremely high RNA affinity. Awaiting further improvements in oligochemistry, we therefore consider 2OMePS AONs currently the most favourable compounds.
   To facilitate clinical application, multiple in vivo studies in animal models are ongoing to develop safe and efficient AON-delivery methods. However, as exon skipping is a sequence-specific therapy, it is desirable to directly target the human DMD gene. We have therefore set up sequence-specific human exon skipping in vivo in transgenic mice carrying the an intact copy of the full-length 2.5 Mb human gene (hDMD). We injected 2OMePS AONs targeting human exons 44, 46 and 49 into the m. gastrocnemicus of hDMD mice, and showed skipping of the human (but not the murine) exons, which persisted for at least 28 days. Based on pre-clinical data obtained by our group and others, we are currently setting up a clinical trial aiming at local dystrophin restoration following intramuscular injections of exon 46 and 51 specific AONs.

Austrália - Steve Wilton é um dos pesquisadores australianos que está estudando uma forma de corrigir o gene da distrofia; utilizando a injeção de oligonucleotídeos eles pretendem "consertar" o gene da distrofina, permitindo a formação de uma proteína defeituosa, mas capaz de corrigir parcialmente os sintomas da doença. Eles já publicaram diversos estudos em camundongos e em células musculares humanas e pretendem iniciar em breve os estudos em seres humanos. O anúncio será feito somente em 2005, no encontro anual dos pais e portadores de distrofia muscular.

França - pesquisadores estudando camundongos com distrofia muscular conseguiram corrigir o gene da distrofina com o uso de oligonucleotídeos. Esta técnica "conserta" o gene da distrofina que passa a produzir uma proteína distrofina, incompleta ou defeituosa, mas capaz de reduzir os sintomas da doença. Os camundongos tratados com esta técnica expressaram a distrofina por muitos meses após a injeção dos oligonucleotídeos. Esta pesquisa foi comentada neste artigo:

Development of an Innovative Technique of Gene Therapy: Exon Skipping

USA - a gentamicina é um antibiótico utilizado por via injetável para infecções graves. Alguns estudos já conseguiram demonstrar que a gentamicina pode corrigir a mutação de ponto na distrofia muscular de Duchenne, na fibrose cística e outras doenças genéticas. Neste artigo, cujo link esta abaixo, os pesquisadores demonstraram que na doença genética denominada ataxia-teleangectasia a gentamicina corrigiu a mutação de ponto de células acometidas pela doença. Infelizmente, como a droga é tóxica, só funciona por via injetável e não se determinou quais os pacientes com mutação de ponto se beneficiarão desta droga mais pesquisas deverão ser feitas para determinar qaundo será possível utilizar esta droga em distrofia. Uma outra droga para mutação de ponto será testada em 2005 nos Estados Unidos em pacientes com Duchenne e pacientes com fibrose cística.

http://www.pnas.org/cgi/content/abstract/101/44/15676?maxtoshow=&HITS=&hits=&RESULTFORMAT=1&andorexacttitle=and&andorexacttitleabs=and&fulltext=muscular+dystrophy&andorexactfulltext=and&searchid=1099621321093_21896&stored_search=&FIRSTINDEX=0&sortspec=date&fdate=11/1/2004&resourcetype=1

USA - esta técnica utilizada em camundongos para tratar excesso de colesterol também poderia ser útil nas distrofias. Este texto eu copiei da Folha de São Paulo (texto de Ricardo Bonalume Neto):"uma das promessas da terapia genética ficou mais próxima das clínicas graças a um trabalho publicado na edição de hoje da revista científica britânica "Nature" (www.nature.com). Foi possível a uma equipe de 25 cientistas da Alemanha e dos Estados Unidos bloquear o funcionamento de um gene e baixar pela metade o colesterol em camundongos utilizando uma nova técnica, baseada na chamada interferência de RNA.
Genes defeituosos podem causar doenças ao orientar a fabricação de proteínas que fazem mal ao corpo. "Silenciar" esses genes é um objetivo que se conseguia obter razoavelmente em células em proveta, o chamado experimento in vitro. Mas era grande a dificuldade em exportar os resultados para dentro de um organismo vivo, o experimento in vivo.
A equipe liderada por Hans-Peter Vornlocher, da empresa farmacêutica Alnylam, da Alemanha, conseguiu criar uma técnica para fazer os pedacinhos de RNA "interferentes" chegarem aos tecidos e silenciarem os genes.
Ironicamente, a idéia era silenciar um gene que facilita o acúmulo de colesterol, e o meio para fazê-lo envolveu conjugar uma molécula de colesterol ao RNA.
Para entender a técnica é preciso lembrar o chamado "dogma central" da biologia molecular.
Para que a informação contida nos genes possa resultar na produção de uma proteína são necessárias duas etapas. A seqüência de DNA do gene é copiada na forma de mRNA (RNA mensageiro) no processo chamado transcrição. Depois, o mRNA se traduz em uma seqüência de proteína.
Um mecanismo natural chamado interferência de RNA (RNAi) pode bloquear a ação do gene. Os cientistas agora produziram sinteticamente pequenos pedaços de RNA capazes de silenciar o gene específico que queriam. Esse RNA sintético -siRNA- recebeu o colesterol, que facilitou a entrada do conjunto nos tecidos celulares. O siRNA grudou no RNA mensageiro e, com ajuda de proteína, cortou o mRNA ou impediu que ele se traduzisse em proteína.
"Avançamos significativamente na RNAi e achamos que podemos aplicar a técnica em humanos", disse Vornlocher ao jornal britânico "The Independent".
Os resultados foram considerados "encorajadores" por John Rossi, do Beckman Research Institute of the City of Hope, de Duarte, Califórnia (EUA), comentando a descoberta em um artigo da mesma revista "Nature". Para Rossi, porém, muitas questões ainda precisam ser respondidas antes de a técnica poder ser usada em seres humanos". A notícia em inglês pode ser lida aqui.

Alemanha - a proliferação de mioblastos pode permitir a regeneração dos músculos em portadores de distrofia muscular; neste estudo realizado em laborátorio com células de portadores de Duchenne os pesquisadores conseguiram aumentar a proliferação de mioblastos com oligonucleotídeos e com a inibição de uma enzima utilizando a técnica do RNA de interferência (conforme descrito na notícia abaixo).

Espanha - realizou-se em junho de 2004 esta reunião de neurologistas europeus na qual foram apresentadas 4 pesquisas em distrofia muscular. Na primeira os autores descrevem a melhora da força e da fadiga muscular em camundongos com distrofia muscular utilizando duas drogas: a IRFI 042, antioxidante, e a PDTC, um inibidor da NF-kB, uma proteína que causa degeneração muscular. Na segunda os pesquisadores encontraram um pequeno resultado com o transplante de células da medula óssea em camundongos com distrofia muscular (baixa expressão da distrofina nos músculos). Na terceira pesquisa os autores encontraram déficits de linguagem em portadores de distrofia muscular de Duchenne (déficit em compressão de sintaxe e gramática, sem dificuldade de leitura). Na quarta pesquisa os autores discutem as causas de insuficiência respiratória na distrofia miotônica (apnéia do sono, fraqueza muscular). Os trabalhos como foram apresentados no Congresso podem ser lidos aqui:

1) Effect of treatment with PDTC and IRFI 042 on strength and fatigue in MDX mice

S. Messina, P. Seminara, M. Aguennouz, M.C. Monici, H. Marini, F. Squadrito, G. Vita (Messina, I)

Previous studies provided evidences that generation of reactive oxygen species and activation of transcription factor NF-kB may play important roles in the pathogenesis of Duchenne muscular dystrophy. We tested whether IRFI 042, a vitamin E-like antioxidant, and PDTC, a NF-kB inhibitor, could have an effect on muscle weakness in mdx mice. We treated 48 5/6-week old mdx and wild type mice with intraperitoneal injections of PDTC (50 mg/kg), IRFI 042 (20 mg/kg), or vehicle, three times a week for five weeks. Data regarding weight, survival and forelimb strength and fatigue were collected. Motor performance measurements were carried out using a grip meter attached to a force transducer which measures peak force generated. Mdx mice treated with IRFI 042 or PDTC showed at the end of treatment a significantly higher forelimb strength than vehicle controls (IRFI 042: +53.6%, p<0.001; PDTC: +53.1%, p<0.05) as well as higher strength normalised to weight (IRFI 042: +57.8%, p<0.001; PDTC: +54%, p<0.05). Furthermore PDTC-treated mdx mice had significantly less fatigue than vehicle animals (-120%, p<0.004).

Our results suggest that PDTC and IRFI 042 might have a beneficial effect on weakness and fatigue in mdx mice. Further studies are needed to investigate the morphological and biochemical substrates of such encouraging preliminary results.

2) Bone marrow transplantation poorly restores dystrophin expression in MDX mice: comparison of GFP and dystrophin expression

F. Chretien, P.A. Dreyfus, P. Caramelle, B. Chazaud, R.K. Gherardi (Créteil, F)

We have previously developed a murine model of bone marrow (BM) transplantation from B6-TgGFP transgenic mice to normal irradiated B6 mice, the cytoplasmic green fluorescent protein (GFP) being used as an unambiguous marker of donor-derived cells in host muscle. Using this model we were able to demonstrate that stem cell marker-expressing cells found in connective tissue and myogenic precursor cells (satellite cells) may be derived from bone-marrow in adulthood. To investigate the therapeutic potential of BM transplantation in muscle diseases such as dystrophinopathies, we compared the results obtained in C57Bl6 (B6) mice and mdx mice, a model for Duchenne muscular dystrophy in which muscle regeneration is dramatically increased. In mdx muscle compared to B6 muscle, we observed numerous GFP+ mononucleated cells corresponding to macrophages and numerous necrotic fibers filled by GFP+ macrophages and myoblasts. The number of GFP+ satellite cells number was similar in mdx and B6 mice 6 months post transplantation. However, GFP+ muscle fibers were more numerous in mdx mice. They were from month 1 post transplantation, a time point showing no GFP+ fiber in B6 mice. Six months post transplantation, 4 fold more GFP+ muscle fibers were found in mdx mice compared to B6 mice.
In contrast, dystrophin expression was only mildly increased (0,65% at month 6) and colocalizations between GFP and dystrophin was rarely found on serial cross sections. We conclude that the nuclear domain of dystrophin is probably much shorter than that of GFP.

3) Language disorders in Duchenne's muscular dystrophy

F. Civati, M. Guglieri, M.G. D' Angelo, A. Tavano, F. Fabbro, M.L. Lorusso, M. Sironi, A.C. Turconi, G.P. Comi, N. Bresolin (Bosisio Parini, San Vito, Milan, I)

Background: Duchenne Muscular Dystrophy (DMD) is a fatal recessive x-linked muscular disease caused by the absence of dystrophin. Dystrophin isoforms are also expressed in the cerebral neocortex and in the cerebellum. Cognitive impairment is described in 1/3 of DMD patients, particularly in patients carrying deletions in the distal part of the gene. Difficulties in verbal skills and reading abilities are more frequently described in English speaking patients. According to the literature children with DMD show linguistic deficits already in the early phases of language development which mainly consist of poor expressive verbal abilities and deficits in short-term memory. These observations suggest that in some cases dystrophinopathy may be associated to language disorders. Preliminary results in our group of Italian speaking children showed deficit in Grammatical and Syntax Comprehension.
Aims of the study are:
1) to describe the language and reading ability in a group of italian DMD children
2) to clarify the nature of the language and reading deficits
Patients: 13 children with DMD (mean age 8,3 years; standard deviation 1,7) were diagnosed according to international standard criteria. Full Intelligence Quotient(assessed using Wechsler Intelligence Scale) was >70.
Methods: Language and Reading abilities were determined through: “Test dello sviluppo Morfosintattico”, Battery of standardized tests, Battery to evaluate Dyslexia and Dysortography and Tasks of correctness and rapidity. To exclude additional cognitive deficits we evaluated attention/executive functions domain and memory and learning domain thought a Developmental Neuropsychological Assessment (NEPSY particularly: Auditory attention and response set - Visual attention - List learning - Memory for names).
Results: 8 patients out of 13 showed deficit in Syntax Comprehension. 7 patients out of 13 manifested deficits in Grammatical Comprehension. No DMD patients (except one) presented disabilities in reading. Most of the patients showed mild attention and memory deficits.
Discussion: An early identification of the language and eventually attention/memory difficulties, would be important for an early treatment, to support DMD children in their learning course.

4) Sleep apnoea does not simply attribute to respiratory failure in myotonic dystrophy: evaluation by somnography

H. Takada, S. Kon (Namioka, JP)


Sleep apnoea and hypopnoea have been reported in myotonic dystrophy (MD), but it is unclear whether those are simply attributable to respiratory impairment as well as respiratory muscle weakness. The aim of this study was to assess the correlation of the disrupted nocturnal sleep and awake respiratory function, and to deduce a mechanism of respiratory failure in MD. The study population comprised eighteen patients with MD and seventeen patients with other types of muscular dystrophy for a control group. Patients in the control group were chosen to represent a similar range of the results of routine spirometry examination, particularly the expected/observed forced vital capacity (%VC). Arterial blood gases were also examined early in the morning. Sleep apnoea and hypopnoea were evaluated in all patients using somnography (Sleep Tester LT-200, Fukuda Denshi Co., Japan). The number of apnoea and hyponoea during night (NA) was counted and types of apnoea were judged; the percentage of central type apnoea (%CSA) and obstructive apnoea (%OSA) among total apnoea. Transcutaneous recording of oxygen saturation during night were simultaneously performed. The mean nadir and minimal value of oxygen saturation were obtained. The apnoea index (AI) and the nocturnal hypoxia index (NHI) were calculated. The mean age of the MD group was significantly younger than that of the control group (42.9 +/- 11.7 vs. 51.6 +/- 12.8 years). There was no significant difference in the %VC between the two groups (63.0 +/- 15.4 vs. 65.7 +/- 23.4). The mean PaO2 in MD was significantly lower and the mean PaCO2 in MD was higher than those in the control (78.8 +/- 13.2 vs. 94.1 +/- 10.9 mmHg, 49.1 +/- 3.9 vs. 40.3 +/- 4.9 mmHg). The mean nadir (94.7 +/- 1.6 vs. 96.9 +/- 0.7 mm Hg) and minimal value (73.0 +/- 15.9 vs. 85.6 +/- 7.5 mm Hg) of oxygen saturation in MD were significantly lower than those in the control. The mean NHI in MD was significantly higher than that in the control (96.1 +/- 45.3 vs. 36.0 +/- 16.7). On the other hand, there were not significant differences in the NA, the %CSA, the %OSA, or the AI between the two groups. Moreover, all the parameters for apnoea did not correlate with the results of spirometry or arterial blood gases, although the AI correlated with the NHI or the %CSA in MD. Our results suggest that respiratory failure in MD is not simply owing to sleep apnoea or respiratory muscle weakness, but might be due to impaired chemosensitivity or ventiratory output. 

USA - neste estudo foram utilizados em camundongos com distrofia os  vetores virais com microgene da distrofina. Os animais jovens apresentaram melhora com a terapia gênica, o que não foi observado em camundongos mais velhos. Os músculo analisados apresentaram melhora nos camundongos mais jovens com maior expressão da distrofina.

(In Press: Molecular Therapy, 2004) Adeno-Associated Virus-Mediated Microdystrophin Expression Protects Young mdx Muscle from Contraction-Induced Injury

Mingju Liu, Yongping Yue, Scott Q. Harper, Robert W. Grange, Jeffrey S. Chamberlain, and Dongsheng Duan - USA

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is the most common inherited lethal muscle degenerative disease. Currently there is no cure. Highly abbreviated microdystrophin cDNAs were developed recently for adeno-associated virus (AAV)-mediated DMD gene therapy. Among these, a C-terminaltruncated DR4-R23/DC microgene (DR4/DC) has been considered as a very promising therapeutic candidate gene. In this study, we packaged a CMV.DR4/DC cassette in AAV-5 and evaluated the transduction and muscle contractile profiles in the extensor digitorum longus muscles of young (7- week-old) and adult (9-month-old) mdx mice. At ~3 months post-gene transfer, 50–60% of the total myofibers were transduced in young mdx muscle and the percentage of centrally nucleated myofibers was reduced from ~70% in untreated mdx muscle to ~22% in microdystrophin-treated muscle. Importantly, this level of transduction protected mdx muscle from eccentric contractioninduced damage. In contrast, adult mdx muscle was more resistant to AAV-5 transduction, as only ~30% of the myofibers were transduced at 3 months postinfection. This transduction yielded marginal protection against eccentric contraction-induced injury. The extent of central nucleation was also more difficult to reverse in adult mdx muscle (from ~83% in untreated to ~58% in treated). Finally, we determined that the DR4/DC microdystrophin did not significantly alter the expression pattern of the endogenous full-length dystrophin in normal muscle. Neither did it have any adverse effects on normal muscle morphology or contractility. Taken together, our results suggest that AAVmediated DR4/DC microdystrophin expression represents a promising approach to rescue muscular dystrophy in young mdx skeletal muscle.

USA - alguns grupos no Japão, Austrália,  Holanda e Inglaterra estão pesquisando o uso de oligonucleotídeos no tratamento da distrofia muscular de Duchenne. Nesta forma de distrofia o gene é "consertado" e não substituido.  Por causa da expectativa criada com esta terapia o Comite Europeu de Doenças Neuromusculares publicou uma série de perguntas e respostas sobre este tratamento. As informações mais importantes são:

a) esta forma de terapia não é a cura da doença; com ela a distrofia de Duchenne é "transformada" em uma distrofia de Becker com redução da progressão da doença.

b) um dos pontos mais negativos é que serão realizados previamente estudos em seres humanos para testar a segurança do método. O problema é que estes estudos demorarão cerca de 2 a 4 anos, o que é um tempo muito grande para portadores de distrofia muscular.

c) que os críterios de seleção levarão em conta o tipo de alteração genética, a idade, e inúmeros outros critérios.

É bastante complicado explicar como funcionarão os oligonucleotídeos mas as explicações deste texto são bem mais simples do que os textos médicos. Assim  que for possível tentarei traduzí-las para o português. 


 

Japão - a gentamicina é um antibiótico que já foi testado em mutação de ponto na distrofia muscular de Duchenne; no entanto não são todos os pacientes com mutação de ponto que melhoram com a gentamicina. Neste estudo os autores descrevem um método simples para identificar os pacientes que melhoraram com o uso da gentamicina. Eles observaram que os pacientes que tinham a mutação tipo TGA no gene respondiam ao tratamento, enquanto os com mutação TAA ou TAG não. Quando este teste estiver disponível a gentamicina poderá ser testada na distrofia muscular de Duchenne.

(In Press: Brain & Development, 2004): A novel approach to identify Duchenne muscular dystrophy patients for aminoglycoside antibiotics therapy NEW

Shigemi Kimura, Kaori Ito, Toshihiko Miyagi, Takashi Hiranuma, Kowasi Yoshioka, Shirou Ozasa, Makoto Matsukura, Makoto Ikezawa, Masafumi Matsuo,Yasuhiro Takeshima, Teruhisa Miike  - Japan

Abstract

Aminoglycoside antibiotics have been found to suppress nonsense mutations located in the defective dystophin gene in mdx mice, suggesting a possible treatment for Duchenne muscular dystrophy (DMD). However, it is very difficult to find patients that are applicable for this therapy, because: (1) only 5-13% of DMD patients have nonsense mutations in the dystrophin gene, (2) it is challenging to find nonsense mutations in the gene because dystrophin cDNA is very long (14 kb), and (3) the efficiency of aminoglycoside-induced read-through is dependent on the kind of nonsense mutation. In order to develop a system for identifying candidates that qualify for aminoglycoside therapy, fibroblasts from nine DMD patients with nonsense mutation of dystrophin gene were isolated, induced to differentiate to myogenic lineage by AdMyoD, and exposed with gentamicin. The dystrophin expression in gentamicin-exposed myotubes was monitored by in vitro dystrophin staining and western blotting analysis. The results showed that gentamicin was able to induce dystrophin expression in the differentiated myotubes by the read-through of the nonsense mutation TGA in the gene; a read-through of the nonsense mutations TAA and TAG did not occur and consequently did not lead to dystrophin expression. Therefore, it is speculated that the aminoglycoside treatment is far more effective for DMD patients that have nonsense mutation TGA than for patients that have nonsense mutation TAA and TAG. In this study, we introduce an easy system to identify patients for this therapy and report for the first time, that dystrophin expression was detected in myotubes of DMD patients using gentamicin.

China - este grupo de pesquisa criou um vetor viral para utilização na terapia gênica de camundongos com distrofia muscular. Neste estudo os vírus foram injetados em artérias e promoveram expressão do gene nos músculos, prolongadamente. É mais uma evidência da possibilidade desta forma de terapia gênica para o tratamento da distrofia muscular humana.

http://www.pnas.org/cgi/content/abstract/0406700102v1?maxtoshow=&HITS=&hits=&RESULTFORMAT=1&andorexacttitle=and&andorexacttitleabs=and&fulltext=muscular+dystrophy&andorexactfulltext=and&searchid=1103384614512_7179&stored_search=&FIRSTINDEX=0&sortspec=date&fdate=12/1/2004&resourcetype=1

Inglaterra - este ano divulgamos vários artigos com o uso de oligoribonucleotídeos que atuariam "consertando" o gene defeituoso. Neste estudo o tratamento foi realizado em camundongos com injeções semanais de oligoribonucleotídeos associados a polímeros (não são os vetores virais utilizados em outros estudos). Houve expressão da distrofina nos músculos diafragma, gastrocnêmio, músculos intercostais mas não no coração. Este é mais um significativo avanço neste método de tratamento. O resumo do artigo em inglês que será publicado em breve está a seguir:

Systemic delivery of antisense oligoribonucleotide restores dystrophin expression in body-wide skeletal muscles

http://www.pnas.org/cgi/content/abstract/0406700102v1?maxtoshow=&HITS=&hits=&RESULTFORMAT=1&andorexacttitle=and&andorexacttitleabs=and&fulltext=muscular+dystrophy&andorexactfulltext=and&searchid=1103384614512_7179&stored_search=&FIRSTINDEX=0&sortspec=date&fdate=12/1/2004&resourcetype=1

Qi Long Lu, Adam Rabinowitz, Yun Chao Chen , Toshifumi Yokota, HaiFang Yin, Julia Alter, Atif Jadoon , George Bou-Gharios, and Terence Partridge - United Kingdom

Antisense oligonucleotide-mediated alternative splicing has great potential for treatment of Duchenne muscular dystrophy (DMD) caused by mutations within nonessential regions of the dystrophin gene. We have recently shown in the dystrophic mdx mouse that exon 23, bearing a nonsense mutation, can be skipped after intramuscular injection of a specific 2'-O-methyl phosphorothioate antisense oligoribonucleotide (2OMeAO). This skipping created a shortened, but in-frame, transcript that is translated to produce near-normal levels of dystrophin expression. This expression, in turn, led to improved muscle function. However, because DMD affects muscles body-wide, effective treatment requires dystrophin induction ideally in all muscles. Here, we show that systemic delivery of specific 2OMeAOs, together with the triblock copolymer F127, induced dystrophin expression in all skeletal muscles but not in cardiac muscle of the mdx dystrophic mice. The highest dystrophin expression was detected in diaphragm, gastrocnemius, and intercostal muscles. Large numbers of fibers with near-normal level of dystrophin were observed in focal areas. Three injections of 2OMeAOs at weekly intervals enhanced the levels of dystrophin. Dystrophin mRNA lacking the targeted exon 23 remained detectable 2 weeks after injection. No evidence of tissue damage was detected after 2OMeAO and F127 treatment either by serum analysis or histological examination of liver, kidney, lung, and muscles. The simplicity and safety of the antisense protocol provide a realistic prospect for treatment of the majority of DMD mutations. We conclude that a significant therapeutic effect may be achieved by further optimization in dose and regime of administration of antisense oligonucleotide.

França - já em 2003 tinhamos divulgado os resultados dos primeiros casos de terapia gênica na França; estes resultados são finalmente publicados neste artigo. Nove pacientes com Duchenne ou Becker receberam no músculo radial um vetor com o gene da distrofina. Na biópsia realizada 3 semanas após o vetor foi detectado em todos os pacientes no local de aplicação. A expressão da distrofina foi detectada em 6 pacientes, em porcentagem pequena. Não houve reação imunológica ao tratamento e nem efeitos colaterais. Trata-se de um estudo promissor mais ainda muito inicial.

USA - a PTC, empresa de biotecnologia que recebeu uma vultuosa quantia da MDA e do Parent Project está estudando a droga PTC124 na mutação de ponto da fibrose cística e da distrofia muscular de Duchenne iniciou o estudo da droga em múltiplas doses em pessoas normais para testar a segurança do produto. O estudo de dose única já foi realizado e será divulgado no primeiro trimestre de 2005. No segundo semestre do ano serão iniciados os estudos em pacientes com distorfia muscular de Duchenne.

USA - Parent Project, entidade americana de pais de portadores de distrofia muscular de Duchenne investiu mais de 1 milhão de dólares na empresa PTC para pesquisa de drogas. A primeira droga que será testada é a PTC124 cujos estudos já se iniciaram (ver notícia abaixo). Neste texto eles esclarecem como serão realizados os estudos iniciais. Como já descrevemos a maior preocupação é conhecer mais sobre a droga, gosto, dose de administração, eliminação, efeitos positivos e efeitos colaterais. É uma pesquisa ainda inicial e está droga só será útil em pacientes com Duchenne portador de mutação de ponto.

USA - em 2001 este grupo de pesquisadores já tinha realizado uma pesquisa demonstrando os bons resultados utilizando a terapia gênica com a alfa 7 beta 1 integrina em camundongos. Eles utilizam camundongos sem distrofina e sem utrofina. Os resultados agora são mais completos e eles conseguem entender o que ocorreu com os camundongos; a estrutura da célula se mantem com este tratamento e há aumento das células satélites, responsáveis pela regeneração. Além disso ocorre retardo do aparecimento da lesão cardíaca nos camundongos; a terapia gênica com esta integrina inibe o desenvolvimento da lesão muscular e aumenta a sobrevida.

O estudo anterior deste grupo pode ser lido aqui. O vídeo do estudo anterior pode ser visto aqui.

França - no dia 7/01/2005 noticiamos uma pesquisa na qual o aumento da alfa 7B integrina diminuiu os sintomas da distrofia muscular em camundongos. Neste pesquisa com camundongos os animais foram tratados com L-arginina. Os animais apresentaram aumento da expressão da alfa 7 B integrina com este tratamento e o músculo diafragma apresentou redução das alterações degenerativas. Este pode ser um caminho para tratamento da doença até que um tratamento definitivo apareça. Este estudo será publicado em breve. O resumo, em inglês, pode ser lido abaixo:

(IN PRESS: FEBS Letters, 2005): α7B integrin changes in mdx mouse muscles after L-arginine administration

Delphine Chazalette, Karim Hnia, François Rivier, Gérald Hugon and Dominique Mornet - France

Abstract

Muscle fibers attach to laminin in the basal lamina using two mechanisms, i.e., dystrophin with its associated proteins and α7β1 integrin. In humans, gene-mutation defects in one member of these complexes result in muscular dystrophies. This study revealed changes after L-arginine treatment of utrophin-associated proteins and the α7B integrin subunit in mdx mouse, a dystrophin-deficient animal model. In the two studied muscles (cardiac muscle and diaphragm), the α7B integrin subunit was increased in 5-week-old treated mice. Interestingly, the diaphragm histopathological appearance was significantly improved by L-arginine administration. These results highlight a possible way to compensate for dystrophin deficiency via α7β1 integrin.

USA - miostatina é uma proteína que inibe o crescimento muscular; alguns estudos tem demonstrado que o bloqueio ou eliminação da miostatina contribui para aumento da massa e da força muscular. Neste estudo com camundongos deficientes em laminina, uma forma grave de distrofia muscular em camundongos. A introdução do gene da miostatina não contribuiu para melhorar a força muscular e aumentou a mortalidade dos animais.

Holanda - um dos entraves da terapia gênica é a escolha do melhor vetor viral para entrega do gene aos músculos. Este trabalho descreve um novo vetor para entrega do gene integral da distrofina aos músculos. O gene da distrofina é muito grande e este é uma dificuldade adicional para a terapia gênica. Este vetor foi testado em células e em camundongos. São estudos ainda bem iniciais. O resumo do artigo em inglês, que será publicado em março, pode ser lido abaixo:

(IN PRESS: Journal of Virology, March 2005, p. 3146-3162, Vol. 79, No. 5 ):Transfer of the Full-Length Dystrophin-Coding Sequence into Muscle Cells by a Dual High-Capacity Hybrid Viral Vector with Site-Specific Integration Ability NEW

Manuel A. F. V. Gonçalves, Gijsbert P. van Nierop,Marloes R. Tijssen, Pierre Lefesvre,Shoshan Knaän-Shanzer, Ietje van der Velde, Dirk W. van Bekkum,Dinko Valerio, and Antoine A. F. de Vries - The Netherlands

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is caused by mutations in the DMD gene, making it a potential target for gene therapy. There is, however, a scarcity of vectors that can accommodate the 14-kb DMD cDNA and permanently genetically correct muscle tissue in vivo or proliferating myogenic progenitors in vitro for use in autologous transplantation. Here, a dual high-capacity adenovirus-adeno-associated virus (hcAd/AAV) vector with two full-length human dystrophin-coding sequences flanked by AAV integration-enhancing elements is presented. These vectors are generated from input linear monomeric DNA molecules consisting of the Ad origin of replication and packaging signal followed by the recently identified AAV DNA integration efficiency element (p5IEE), the transgene(s) of interest, and the AAV inverted terminal repeat (ITR). After infection of producer cells with a helper Ad vector, the Ad DNA replication machinery, in concert with the AAV ITR-dependent dimerization, leads to the assembly of vector genomes with a tail-to-tail configuration that are efficiently amplified and packaged into Ad capsids. These dual hcAd/AAV hybrid vectors were used to express the dystrophin-coding sequence in rat cardiomyocytes in vitro and to restore dystrophin synthesis in the muscle tissues of mdx mice in vivo. Introduction into human cells of chimeric genomes, which contain a structure reminiscent of AAV proviral DNA, resulted in AAV Rep-dependent targeted DNA integration into the AAVS1 locus on chromosome 19. Dual hcAd/AAV hybrid vectors may thus be particularly useful to develop safe treatment modalities for diseases such as DMD that rely on efficient transfer and stable expression of large genes.

USA e Japão - os pesquisadores ainda não conseguiram decidir qual o melhor método para levar o gene da distrofia a todos os músculos. Por isto muitas pesquisas são feitas para observar os resultados de diferentes vírus em animais. Esta semana dois artigos mostram sucesso com o uso de dois vetores virais diferentes para utilização em terapia gênica. Os artigos são os seguintes:

Stable transduction of myogenic cells with lentiviral vectors expressing a minidystrophin

Effective repetitive dystrophin gene transfer into skeletal muscle of adult mdx mice using a helper-dependent adenovirus vector expressing the coxsackievirus and adenovirus receptor (CAR) and dystrophin

Esta falta de um consenso sobre o melhor vírus faz com que novas pesquisas sejam feitas e retardam o início de estudo em seres humanos.

Japan - um  dos problemas da terapia gênica é a escolha do vetor para levar o gene até o músculo e como adminstrar este tratamento. O Dr. Matsuo estuda há muito tempo uma técnica de correção do gene da distrofina, com oligonucleotídeos. Neste estudo em camundongos ele injetou os oligonucleotídeos por via peritoneal, sem estar ligado a nenhum vetor viral. Ele conseguiu demonstrar que após 2 dias e até por 14 dias houve expressão da distrofina nos músculos demonstrando que é possível corrigir o gene por via sistêmica e sem utilizar nenhum vetor viral. O resumo deste artigo, que será publicado em breve, pode ser lido abaixo:

(IN PRESS: Brain e Development, 2005) Intraperitoneal administration of phosphorothioate antisense oligodeoxynucleotide against splicing enhancer sequence induced exon skipping in dystrophin mRNA expressed in mdx skeletal muscle

Yasuhiro Takeshima, Mariko Yagi,  Hiroko Wada, Masafumi Matsuo - Japan

Abstract

Antisense oligodeoxynucleotide against the splicing enhancer sequence (SES) in exon 19 of the dystrophin gene have been shown to induce exon 19 skipping and promote the expression of internally deleted dystrophin by correcting the translational reading frame in the cultured Duchenne muscular dystrophy (DMD) myocytes with the deletion of exon 20. Transfection of the antisense oligodeoxynucleotide, therefore, has been proposed as a promising means for therapeutic modification of dystrophin mRNA of DMD, a fatal disorder caused by defects in the dystrophin gene. A systemic delivery method targeting the large number of diseased muscles remains to be established for clinical application of antisense oligodeoxynucleotide. In this study, we investigated capability of oligodeoxynucleotide transfer into the skeletal muscles of mdx mouse, a mouse model of DMD. Thirty-one mer phosphorothioate oligodeoxynucleotide complementary to the SES of dystrophin exon 19 was intraperitoneally administered to mdx mice without any carrier. Histochemical study disclosed that fluorescencelabeled oligodeoxynucleotide appeared in the nuclei of femoral skeletal muscle cell at the second day after injection of 20 mg/kg BW oligodeoxynucleotide, and still visible at 14th day. Reverse transcription (RT)-PCR analysis of dystrophin transcript in these cells disclosed that a proportion of it showed skipping of exon 19 from second to seventh day after injection. These results showed that the intraperitoneally administered oligodeoxynucleotide could be transfected to nucleus of mdx skeletal muscle without any carrier and was able to induce exon skipping in vivo.

 

Holanda - grupo de especialistas se reuniram na Holanda para discutir os protocolos existentes para tratamento da distrofia muscular com oligonucleotídeos, uma maneira de corrigir a doença, ou amenizar os sintomas. A propósito desta reunião a revista Neuromuscular Disorders publicou um editorial sobre o tema. As conclusões do editorial podem ser lidas abaixo, mas as mais  importantes informações deste editorial são:

a) o uso de oligonuleotídeos não pode ser considerado como uma forma de terapia gênica;

b) os oligonulceotídeos podem fazer a celula produzir a distrofina, mas o defeito genético continuará;

c) não se sabe por quanto tempo este tratamento irá funcionar e se deverá ser repetido muitas vezes;

d) pesquisas serão necessárias para decidir qual o melhor método de levar os oligonucleotideos para os músculos;

e) este tratamento visa amenizar os sintomas da doença, ou seja transformar uma distrofia de Duchenne em Becker;

f) os pesquisadores alertam que muitos anos serão necessários para que este tratamento esteja definitivamente estabelecido.

(IN PRESS: Neuromuscular Disorders, 2005) Editorial - Antisense oligonucleotides (AO) in the treatment of Duchenne muscular dystrophy: Where are we now?

Concluding comments

Finally, it should be noted that this antisense oligonucleotide induced exon skipping strategy should not be considered as a form of gene therapy. While the effects do occur in the nucleus, as the dystrophin gene is being actively transcribed and processed, no permanent genetic changes are induced. In contrast to the introduction of entire transgenes in plasmid or viral vectors, AOs should be regarded as ‘informational drugs’ [24], which do not encode a complete product. The site of action for AO induced exon skipping is the primary gene transcript, not the gene. Once the AO has been degraded, metabolised or cleared from the nucleus and cell, its biological activity will dissipate. In many respects, it would be difficult to ‘reverse engineer’ a system with a gene transcript better suited for targeted exon skipping than the dystrophin pre-mRNA. Major regions of the dystrophin protein-coding region can be omitted with minor losses in function, as demonstrated by mildly affected or asymptomatic Becker MD patients. The half-life of the protein is several weeks and there should be a slow turn-over of the muscle fibres if the induced protein does restore strength and stability to the muscle. Induced exon skipping would not be readily applicable to small gene transcripts where all exons are essential for function, or if the gene transcript has a short biological halflife. Similarly, the AOs would not be very effective in cells that divide rapidly, thereby diluting any AO taken up into the nucleus to sub-therapeutic levels. In the event that AOs induce very efficient exon skipping in the early trials, the issue of systemic AO delivery must be addressed and it may conceivably take years to demonstrate clinical benefits to the patients. It will be a frustratingly slow process and this will cause major concerns to parents, patients, clinicians, and the researchers. It is essential that the trials be undertaken transparently and meticulously to ensure no harm to the participants and that any reported benefits are reproducible. Exon skipping will not provide a cure for DMD and will only be effective in a subset of patients. Treatment and care has improved the quality and life expectancy of DMD patients. It may be anticipated that the restoration of some dystrophin by targeted exon skipping will provide additional benefit, the extent of which remains to be determined.

USA - o uso de um vírus contendo uma parte do gene da distrofina tem sido experimentado em camundongos; com este tratamento há redução da agressão do músculo e aumento da força muscular, sem que se obtenha a melhora total da doença. Neste estudo os autores estudaram a terapia gênica em camundongos usando um vetor viral com dois genes: o da IGF-1 e o microgene da distrofina. A utilização dos dois genes causou aumento da massa e da força muscular, com redução do grau de degenerção muscular. Portanto esta alternativa pode ser considerada mais eficiente para o tratamento da distrofia muscular. O resumo em inglês do artigo pode ser lido abaixo:

(IN PRESS: Molecular Therapy,2005) Phenotypic Improvement of Dystrophic Muscles by rAAV/Microdystrophin Vectors Is Augmented by Igf1 CodeliveryB

Simone Abmayr, Paul Gregorevic, James M. Allen and Jeffrey S. Chamberlain - USA

The absence of dystrophin in Duchenne muscular dystrophy (DMD) leads to sarcolemmal instability and enhances the susceptibility of muscle fibers to contraction-induced injury. Various viral vectors have been used to deliver mini- and microdystrophin expression cassettes to muscles of dystrophin deficient mdx mice, significantly increasing both the morphological and the functional properties of the muscles. However, dystrophin delivery to adult mdx mice has not yielded a complete rescue of the dystrophic phenotype. Here we investigated a novel strategy involving dual gene transfer of recombinant adeno-associated viral vectors expressing either microdystrophin (rAAV-MDys) or a muscle-specific isoform of Igf-1 (rAAV-mIgf-1). Injection of mdx muscles with rAAV-MDys reduced myofiber degeneration and turnover and increased their resistance to mechanical injury, but did not increase muscle mass or force generation. Injection of mdx muscles with rAAV-mIgf-1 led to increased muscle mass, but did not provide protection against mechanical injury or halt myofiber degeneration, leading to loss of the vector over time. In contrast, co-injection of the rAAV-MDys and rAAV-mIgf-1 vectors resulted in increased muscle mass and strength, reduced myofiber degeneration, and increased protection against contraction-induced injury. These results suggest that a dual-gene, combinatorial strategy could enhance the efficacy of gene therapy of DMD.

http://ajp.amjpathol.org/cgi/content/abstract/166/6/1741?maxtoshow=&HITS=&hits=&RESULTFORMAT=1&andorexacttitle=and&andorexacttitleabs=and&fulltext=muscular+dystrophy&andorexactfulltext=and&searchid=1117318464465_11536&stored_search=&FIRSTINDEX=0&sortspec=date&fdate=5/1/2005&resourcetype=1

França - um dos problemas da terapia gênica na distrofia muscular  é levar o gene até os músculos e fazer este gene funcionar. Nesta pesquisa os autores utilizaram o gene da distrofia acompanhado de um gene fluorescente em camundongos com distrofia muscular. Apesar de conseguir demonstrar que as células ficaram fluorescentes os músculos não expressaram a distrofina em quantidade significante.

Inglaterra - pesquisadores transferiram um gene denominado MGF (mecano fator de crescimento) em camundongos com distrofia muscular e observaram importante aumento da força muscular da ordem de 35 a 40% em 3 semanas. Esta terapia pode ser útil em várias formas de distrofia e em outras doenças que se acompanham de perda de força muscular (câncer, AIDS, senelidade,etc). Não há referências a complicações com este tratamento e os autores pretendem iniciar estudos clínicos em breve. 

USA - os pesquisadores utilizaram camundongos com deficiência em laminina alfa 2. Os animais receberam terapia gênica com adenovirus que levou uma miniatura do gene agrin. Os estudos demonstraram uma melhora das alterações dos músculos dos camundongos tratados; aumento global dos músculos e aumento da sobrevida (quadruplicado). Este é mais um exemplo das possibilidades de tratamento das distrofias com terapia gênica.

França - este é o primeiro protocolo de tratamento da distrofia muscular de Duchenne/Becker com a terapia gênica. Os autores novamente publicam seus resultados. nove pacientes com Duchenne/Becker receberam injeção de plasmídeos contendo o gene da distrofina no músculo radial. Distrofina foi identificada em 6 pacientes com baixa expressão. Não foi identificada a produção de anticorpos antidistrofina nestes meninos. Este grupo pretende prosseguir com estes estudos injetando os plasmídeos em uma perna (protocolo ainda não iniciado).

França - os autores estudaram a terapia gênica em camundongos com distrofia muscular tipo cinturas tipo 2a por deficiência de calpaína 3. Vetores virais com o gene da calpaína 3. As alterações dos músculos regrediram com recuperação da força contrátil, sem evidência de qualquer efeito colateral. É mais um trabalho que demonstra a viabilidade desta terapia gênica em diversas formas de distrofia muscular

Austrália - o uso de oligonucleotídeos pode reduzir os sintomas da distrofia muscular e transformar a distrofia mais severa em uma forma mais branda (por exemplo transformar a distrofia de Duchenne em Becker). Há pelo menos 3 grupos estudando esta possibilidade de tratamento, alguns deles já se preparando para estudos clínicos em seres humanos. Este estudo demonstrou que a aplicação de oligonucleotídeos localizada ou por via sistêmica causa expressão da distrofina em camundongos com distrofia muscular demonstrando mais uma vez a viabilidade desta forma de tratamento.

Holanda - a ídeia não é nova; os pesquisadores estudam o potenciam das células tronco da medula óssea no tratamento da distrofia muscular de Duchenne; a ideía seria utilizar células da medula do próprio paciente e corrigí-las com vetores virais; colocadas em meio de cultura estas células participaram da síntese de novos mioblastos. O estudo em tubo de ensaio mostrou a possibilidade desta forma de tratamento, apesar de que os estudos estão ainda muito no início.

USA - um dos problemas relacionados ao sucesso da terapia gênica é a expressão do gene a longo prazo, isto é, o número de fibras que podem ser corrigidas com este tratamento. Este grupo de trabalho utilizou dois genes em camundongos para tentar corrigir a distrofia muscular; além do gene da distrofina foi utilizado um gene de uma enzima integrase tentando obter melhor sucesso na incorporação do gene da distrofina. O estudo mostrou que com estes dois genes a expressão da distrofina pode aumentar em 5 a 10 vezes o que melhoraria muito o resultado do tratamento.

Esta notícia pode ser lida com outros comentários aqui.

USA - inúmeros estudos prévios com terapia gênica demonstraram pequena expressão do gene nas células musculares. Neste estudo a colocação do fator de crescimento dos fibroblastos no vetor viral aumentou a capacidade de expressão do gene (seis vezes maior). Portanto este fator pode ser útil como auxiliar de formas de terapia gênica para tratamento de distrofias musculares.

Inglaterra - o uso de oligonucleotídeos é uma das alternativas da terapia gênica; funcionaria como um corretor do defeito genético atenuando-o. Neste estudo em camundongos os oligonucleotideos injetados semanalmente aumentaram a expressão de distrofina e melhoraram a função muscular. Apesar da quantidade de distrofina variar entre os músculos é uma alternativa que poderá ser viabilizada em pouco tempo (ver notícia publicada hoje sobre as entidades).

USA - neste estudo foram utilizados os camundongos deficientes em distrofina e em utrofina, que apresentam  fraqueza muscular semelhante a doença humana. Eles foram tratados com o gene da distrofina da retina. Eles apresentaram aumento da força muscular e da sobrevida. O resumo em inglês do artigo que será publicado em breve poderá ser lido abaixo:

(IN PRESS: Neuromuscular Disorders, 2006) Improvement in survival and muscle function in an mdx/utrn−/− double mutant mouse using a human retinal dystrophin transgene

Roger Gaedigk, Douglas J. Law, Kathleen M. Fitzgerald-Gustafson, Steven G. McNulty, Ndona N. Nsumu, Ann C. Modrcin, Robert J. Rinaldi, David Pinson, Stephen C. Fowler, Mehmet Bilgen, Joanne Burns, Stephen D. Hauschka and Robert A. White - USA

Duchenne muscular dystrophy  is a progressive muscle disease characterized by increasing muscle weakness and death by the third decade. mdx mice exhibit the underlying muscle disease but appear physically normal with ordinary lifespans, possibly due to compensatory expression of utrophin. In contrast, double mutant mice (mdx/utrn−/−), deficient for both dystrophin and utrophin die by not, vert, similar3 months and suffer from severe muscle weakness, growth retardation, and severe spinal curvature. The capacity of human retinal dystrophin (Dp260) to compensate for the missing 427 kDa muscle dystrophin was tested in mdx/utrn−/− mice. Functional outcomes were assessed by histology, EMG, MRI, mobility, weight and longevity. MCK-driven transgenic expression of Dp260 in mdx/utrn−/− mice converts their disease course from a severe, lethal muscular dystrophy  to a viable, mild myopathic phenotype. This finding is relevant to the design of exon-skipping therapeutic strategies since Dp260 lacks dystrophin exons 1-29.

USA - células tronco mesenquimais são células musculares com potencial para se transformar em células musculares. Nas doenças genéticas elas não podem ser utilizadas no tratamento da doença porque elas carregam o defeito genético. Nesta pesquisa em laboratório os pesquisadores utilizaram um vetor viral com um microgene da distrofina para corrigir as células tronco mesenquimais de camundongos. Estas células passaram a expressar a distrofina e poderiam ser utilizadas no tratamento da doença. Falta ainda provar que estas células injetadas nos animais sejam capaz de corrigir a doença, escolher a via de administração e muitos outros detalhes para que, no futuro, este estudo possa ser utilizado em seres humanos.

Japão - muitos pesquisadores tem estudado os oligonucleotídeos para tratamento da distrofia muscular de Duchenne; várias equipes iniciarão os estudos ainda este ano (na Alemanha em dois meses por exemplo). Os oligonucleotideos corrigem o defeito genético, melhorando os sintomas da doença. No caso da distrofia muscular de Duchenne ela seria transformada na distrofia de Becker e poderia haver um retardo na evolução da doença. Este grupo japonês divulga os resultados iniciais do primeiro caso tratado, um menino de 10 anos, tratado com  oligonucleotídeos, por via venosa, uma vez por semana por quatro semanas. O tratamento se demonstrou seguro, sem causar efeitos colaterais. A biópsia realizada uma semana após o tratamento demonstrou a expressão do gene da distrofina em apenas 6% das fibras. Este grupo está realizando esta pesquisa em outros pacientes e estas informações precisam ser analisadas mais a longo prazo para se saber se funcionará para o tratamento da doença. O resumo em inglês do artigo recentemente publicado pode ser lido abaixo:

(IN PRESS: Pediatric Research, 2006) Intravenous Infusion of an Antisense Oligonucleotide Results in Exon Skipping in Muscle Dystrophin mRNA of Duchenne Muscular Dystrophy

TAKESHIMA, YASUHIRO; YAGI, MARIKO; WADA, HIROKO; ISHIBASHI, KAZUTO; NISHIYAMA, ATUSHI; SAKAEDA, MIKIO KAKUMOTO TOSHIYUKI; SAURA, RYUICHI; OKUMURA, KATSUHIKO; MATSUO, MASAFUMI - Japan

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a fatal muscle wasting disease that is characterized by muscle dystrophin deficiency. We report that intravenous (IV) infusion of an antisense oligonucleotide created an in-frame dystrophin mRNA from an out-of-frame DMD mutation (via exon skipping) which led to muscle dystrophin expression. A 10-year-old DMD patient possessing an out-of-frame, exon 20 deletion of the dystrophin gene received a 0.5 mg/kg IV infusion of an antisense 31-mer phosphorothioate oligonucleotide against the splicing enhancer sequence of exon 19. This antisense construct was administered at one-week intervals for 4 wk. No side effects attributable to infusion were observed. Exon 19 skipping appeared in a portion of the dystrophin mRNA in peripheral lymphocytes after the infusion. In a muscle biopsy one week after the final infusion, the novel in-frame mRNA lacking both exons 19 and 20 was identified and found to represent approximately 6% of the total reverse transcription PCR product. Dystrophin was identified histochemically in the sarcolemma of muscle cells after oligonucleotide treatment. These findings demonstrate that phosphorothioate oligonucleotides may be administered safely to children with DMD, and that a simple IV infusion is an effective delivery mechanism for oligonucleotides that lead to exon skipping in DMD skeletal muscles.

USA - este estudo foi feito em camundongos com deficiência em distrofina e utrofina; são camundongos que apresentam uma intensa fraqueza muscular; os animais com dois meses de vida foram tratados com vetores contendo um microgene da distrofina. Após dois meses houve uma significativa melhora das alterações musculares  e um significativo aumento da força muscular. Em resumo um resultado bastante promissor. O resumo em inglês do artigo que será publicado em breve está abaixo:

(IN PRESS: Molecular Therapy, 2006) C-Terminal-Truncated Microdystrophin Recruits Dystrobrevin and Syntrophin to the Dystrophin-Associated Glycoprotein Complex and Reduces Muscular Dystrophy in Symptomatic Utrophin/Dystrophin Double-Knockout Mice

Yongping Yue,  Mingju Liu,  and Dongsheng Duany - USA

C-terminal-truncated (DC) microdystrophin is being developed for Duchenne muscular dystrophy gene therapy. Encouraging results have been achieved in the mdx mouse model. Unfortunately, mdx mice do not display the same phenotype as human patients. Evaluating DC microdystrophin in a symptomatic model will be of significant relevance to human trials. Utrophin/dystrophin doubleknockout (u-dko) mice were developed to model severe dystrophic changes in human patients. In this study we evaluated the therapeutic effect of the DR4-R23/DC microdystrophin gene (DR4/DC) after serotype-6 adeno-associated virus-mediated gene transfer in neonatal u-dko muscle. At 2 months after gene transfer, the percentage of centrally nucleated myofiber was reduced from 89.2 to 3.4% and muscle weight was normalized. Furthermore, we have demonstrated for the first time that DC microdystrophin can eliminate interstitial fibrosis and macrophage infiltration and restore dystrobrevin and syntrophin to the dystrophin-associated glycoprotein complex. Interestingly neuronal nitric oxide synthase was not restored. The most impressive results were achieved in muscle force measurement. Neonatal gene therapy increased twitch- and tetanic-specific force. It also brought the response to eccentric contraction-induced injury to the normal range. In summary, our results suggest that the DR4/DC microgene holds great promise in preventing muscular dystrophy.

USA -  esta semana começou o primeiro estudo clínico com terapia gênica em distrofia muscular nos Estados Unidos. O estudo será feito pela AskBio uma empresa de biotecnologia que desenvolveu um vetor viral com o gene da distrofina. Seis meninos com Duchenne deverão ser estudados. Andrew Kilbarger de 8 anos foi o primeiro. Ele recebeu 3 injeções em cada braço; os médicos que examinarão o garoto e os que analisarão os resultados dos exames não saberão em qual braço foi injetado o vetor viral e em qual braço foi injetado placebo (injeção só de soro). Após algumas semanas serão realizadas biópsias para análise dos resultados dos músculos. O estudo é ainda bem inicial e novos estudos deverão ser feitos até que este tratamento seja considerado eficiente e seguro. A maior importância do estudo é ter sido feito nos Estados Unidos. O FDA tinha proibido estudos com terapia gênica em 1999 devido a um incidente fatal com este tratamento. A autorização para este estudo abrirá as portas para outros estudos com terapia gênica em Duchenne e em outras formas de distrofias. Esta notícia teve uma grande repercussão e poderá ser lida em outras páginas da internet com estas abaixo:

First clinical trial of gene therapy for muscular dystrophy now under way

Boy, 8, is pioneer for gene therapy

USA - no dia 1 de abril eu publiquei a notícia que uma criança, Andrew Kilbarger, de oito anos foi a primeira a participar de um estudo experimental e receber a terapia gênica no músculo de seu braço. O vídeo com o Dr. Xiao Xiao, que desenvolveu o mini gene da distrofina e da criança durante o procedimento pode ser visto na página acima.

Holanda - Propensa, uma empresa de biotecnologia e a Universidade de Leiden  receberão aprovação para iniciar o primeiro estudo com oligonucleotídeos na Europa; os oligonucleotídeos são usados para corrigir o gene da distrofina. Estes estudos serão patrocinados por grupos de pais da Europa e dos Estados Unidos. Já há um estudo semelhante no Japão e outros países iniciarão estudos em breve (Austrália, Inglaterra, etc).

Australia - este grupo há algum tempo vem estudando o uso de oligonucleotídeos para corrigir o gene da distrofia muscular. Duas destas pesquisas foram publicadas esta semana, a primeira dela em cães e a segunda em camundongos com distrofia muscular. Utilizadando esta técnica em cães ele concluiu que é possível com este tratamento induzir uma grande e sustentada quantidade de distrofina  e que esta etapa é uma preparação para os experimentos em seres humanos. Na pesquisa em camundongos ele utilizou oligonucleotídeos polivalentes, para tratamento da distrofia muscular com mutações em exons diferentes. Isto facilitaria o tratamento em seres humanos e a conclusão deste trabalho é de que a técnica é possível.

USA - neste estudo os pesquisadores administraram a camundongos com distrofia muscular um vetor viral por via intravascular carregando um microgene da distrofina. O tratamento restabeleceu a expressão do gene da distrofina nos músculos dos membros, no coração e no diafragma. As alterações patológicas se reduziram e houve aumento da sobrevida dos animais. Os comentários deste artigo também podem ser lidos aqui.

Itália - neste estudos os pesquisadores utilizaram camundongos deficientes em alfa-sarcoglicans, expressando uma forma de de distrofia tipo cinturas; eles injetaram nestes camundongos os  mesangioblastos que são células tronco de vasos sanguineos; os mesangioblastos foram previamente expostos a muitas substâncias antes de serem injetados nos camundongos; mais de 80% das fibras passaram a expressar a alfa-sarcoglican, com aumento superior a 5 vezes os animais do grupo controle. Este estudo define um modo de estimular estas células a se transformar em células musculares e com um resultado que permita corrigir as alterações degenerativas dos músculos.

Inglaterra - neste artigo o autor faz uma revisão das várias técnicas de terapia gênica em estudo para tratamento de distrofia muscular de Duchenne. Os conhecimentos adquiridos nos últimos quatro anos possibilitam que estudos clínicos já possam ser realizados.

USA - os pesquisadores utilizaram camundongos que apresentavam os sinais característicos da distrofia miotônica; eles conseguiram neutralizar o RNA dos animais e observaram regressão dos sintomas da doença, abrindo a possibilidade desta terapia ser testada na distrofia miotônica humana. Os comentários destes artigos podem ser lidos também nos links abaixo:

http://www.mdausa.org/research/060802rna_mmd.html

http://news.bbc.co.uk/1/hi/health/5223314.stm

Holanda - no Congresso Mundial de Músculo que ocorreu na Bélgica esta semana foi anunciado o resultado do primeiro paciente com Duchenne tratado com oligonucleotídeos. A finalidade deste tratamento é consertar o gene e permitir a produção de uma parte da proteína distrofina tentando retardar a evolução da doença. Os oligonucleotídeos foram injetados em apenas um músculo e após um mês a biópsia demonstrou a presença da distrofina no local aplicado. Este tratamento já foi realizado em três pacientes sem efeitos colaterais. É importante lembrar que é um resultado muito promissor mas a pesquisa foi feita em apenas um músculo e o resultado divulgado é de apenas uma criança. O texto em inglês do comunicado pode ser lido abaixo:

UPDATE ON EXON SKIPPING

Dear all,
Today Judith van Deutekom, Prosensa and LUMC Leiden, will present on the World Muscle Society conference in Brugge the preliminary results of the ongoing clinical trial in the Netherlands.
After intra muscular injection of AON skipping exon 51 in the first patiënt, they were able to demonstrate the presence of truncated Dystrophin in the biopsy which was taken earlier this week, one month after injection. So far 3 patients are injected without side effects.
Although more results will follow in the next month we felt you all might like to know this first information.
Kind regards,
Elizabeth Vroom
Amsterdam, October 2006
UPPMD
and
Pat Furlong, President
Parent Project Muscular Dystrophy
 

França - em um estudo teórico este artigo analisa a possibilidade de corrigir a distrofia muscular de Duchenne com oligonucleotídeos. O objetivo é transformar a distrofia de Duchenne em distrofia de Becker, fazendo com que o músculo produza alguma forma de distrofina. Em geral os pesquisadores constroem oligonucleotídeos para corrigir alguma mutação. Eles sugerem que oligonucleotídeos multiexon poderia corrigir mais de um tipo de mutação e permitir a correção de 63% dos casos da doença.

Itália -  esta pesquisa é do mesmo grupo que recentemente demonstrou em cães bons resultados com o uso de mesangioblastos para tratamento da distrofia muscular. Neste estudo em camundongos os mesangioblastos foram tratados previamente, antes da injeção, com doadores de óxido nítrico. Estas células tratadas foram mais eficientes para tratamento da distrofia muscular do que as células não tratadas. O resumo em inglês desta pesquisa pode ser lido abaixo:

(IN PRESS: Journal of Cell Science 2006; 119: 5114-5123) Ex vivo treatment with nitric oxide increases mesoangioblast therapeutic efficacy in muscular dystrophy 

Clara Sciorati, Beatriz G. Galvez, Silvia Brunelli, Enrico Tagliafico, Stefano Ferrari, Giulio Cossuand Emilio Clementi - Italy

Muscular dystrophies are characterized by primary wasting of skeletal muscle for which no satisfactory therapy is available. Studies in animal models have shown that stem cell-based therapies may improve the outcome of the disease, and that mesoangioblasts are promising stem cells in this respect. The efficacy of mesoangioblasts in yielding extensive muscle repair is, however, still limited. We found that mesoangioblasts treated with nitric oxide (NO) donors and injected intra-arterially in {alpha}-sarcoglycan-null dystrophic mice have a significantly enhanced ability to migrate to dystrophic muscles, to resist their apoptogenic environment and engraft into them, yielding a significant recovery of {alpha}-sarcolgycan expression. In vitro NO-treated mesoangioblasts displayed an enhanced chemotactic response to myotubes, cytokines and growth factors generated by the dystrophic muscle. In addition, they displayed an increased ability to fuse with myotubes and differentiating myoblasts and to survive when exposed to cytotoxic stimuli similar to those present in the dystrophic muscle. All the effects of NO were cyclic GMP-dependent since they were mimicked by treatment with the membrane permeant cyclic-GMP analogue 8-bromo-cGMP and prevented by inhibiting guanylate cyclase. We conclude that NO donors exert multiple beneficial effects on mesoangioblasts that may be used to increase their efficacy in cell therapy of muscular dystrophies.

USA - neste estudo realizado os autores injetaram vírus contendo o gene da distrofina no músculo de cães (dois tipos de vírus); ao contrário do que os autores observaram em camundongos os cães apresentaram uma reação imunológica a injeção do vírus. Se estes resultados se confirmarem em outros estudos esta modalidade de tratamento precisará obrigatoriamente ser acompanhada de drogas que reduzem a imunidade.

USA - o maior problema da terapia gênica na distrofia muscular é a chegada dos vírus a todos os músculos e a correção do defeito da maioria das células musculares. Nesta pesquisa os autores criaram um vetor viral para transportar o gene da distrofina. A injeção do vetor viral em camundongos com distrofia muscular causou expressão do gene em grande quantidade de células musculares demonstrando a viabilidade desta terapia para tratamento das distrofias musculares

China  -  os pesquisadores construiram um vetor viral para levar o microgene da distrofina, uma parte do gene que pode exercer a mesma função do gene inteiro. O vetor foi utilizado para tratamento das células mesenquimais dos camundongos com distrofia muscular. Os resultados demonstraram que este vetor  foi capaz de tratar as células mesenquimais dos camundongos. Se isto se confirmar em seres humanos será possível obter células de portadores de distrofia muscular e tratá-las em laborátorio. Quando injetadas estas células poderiam corrigir a doença. O resumo do artigo em inglês pode ser lido abaixo:

Chinese Journal of Biotechnology, 2007; 23(1):27-32) Construction of Recombinant Adenovirus Including Microdystrophin and Expression in the Mesenchymal Cells of mdx Mice

Fu XIONG, Cheng ZHANG, Shao-Bo XIAO, Mei-Shan LI, Shu-Hui WANG, Mei-Juan YU and Yan-Chang SHANG

Construction of recombinant adenovirus, which contain human microdystrophin, and then transfection into mesenchymal cells (MSCs) of mdx mice were done, and genetically-corrected isogenic MSCs were acquired; the MSCs transplantation into the mdx mice was then done to treat the Duchenne muscular dystrophy (DMD). Microdystrophin cDNA was obtained from recombinant plasmid pBSK-MICRO digested with restrictive endonuclease Not I; the production was inserted directionally into pShuttle-CMV. The plasmid of pShuttle-CMV-MICRO was digested by Pme I, and the fragment containing microdystrophin was reclaimed and transfected into E. coli BJ5183 with plasmid pAdeasy-1. After screening by selected media, the extracted plasmid of positive bacteria was transfected into HEK293 cells with liposome and was identified by observing the CPE of cells and by the PCR method. Finally, MSCs of mdx mice were infected with the culture media containing recombinant adenovirus, and the expression of microdystrophin was detected by RT-PCR and immunocytochemistry. Recombinant adenovirus including microdystrophin was constructed successfully and the titer of recombinant adenovirus was about 5.58 × 1012 vp/mL. The recombinant adenovirus could infect MSC of mdx mice and microdystrophin could be expressed in the MSC of mdx mice. Recombinant adenovirus including microdystrophin was constructed successfully, and the microdystrophin was expressed in the MSC of mdx mice. This lays the foundation for the further study of microdystrophin as a target gene to correct the dystrophin-defected MSC for stem cell transplantation to cure DMD.

China - esta é mais uma pesquisa do Dr. Zhang já citado inúmeras vezes por aqui por suas pesquisas pioneiras, que infelizmente nem sempre são aceitas aqui no ocidente pela dificuldade de comprovação. Neste estudo foi construído um vetor viral portando o microgene da distrofina capaz de produzir o mesmo efeito que um gene inteiro. Este vírus foi usado para tratamento de células tronco de camundongos com distrofia muscular. Segundo o resumo apresentado os resultados foram bons apesar de não haver detalhes da intensidade desta melhora.

USA - PGC- 1 alfa é um ativador de genes. Este ativador aumenta nos exercícios e aumenta a quantidade de mitocôndrias, um organela responsável pela energia das células. O camundongo com distrofia muscular tem redução da PGC-1 alfa. Camundongos com distrofia muscular e geneticamente modificados para apresentar uma superexpressão da PGC-1 alfa apresentaram redução dos sintomas da doença e aumento da força muscular. Não há uma maneira, até o momento, de ativar a PGC-1 alfa em seres humanos.

USA - a ídeia de utilizar vetores virais como carregadores do gene da distrofina tem sido tentada há algum tempo. Nesta pesquisa. Um dos insucessos deste tratamento se relaciona a intensa reação imunológica do organismo aos vírus e/ou gene da distrofina. Nesta pesquisa os autores observaram que o uso de drogas imunossupressoras permitiram a expressão do gene mais prolongadamente com redução da reação imunológica.

USA - o microgene da distrofina mantém a mesma capacidade do gene inteiro e nesta pesquisa foi administrado através de vetores virais a camundongos por via sistêmica. Os autores observaram melhora global da função cardíaca, mostrando a viabilidade desta possibilidade de tratamento.

USA - será realizado no final do mês em Seattle o 10o Encontro Anual da Sociedade Americana de Terapia Gênica. Neste encontro serão apresentadas 39 pesquisas que se relacionam com terapia gênica em distrofia muscular. São pesquisas em tubos de ensaio, em cães e em camundongos. São diversas maneira de levar o gene até o músculo e várias formas de tentar tratar a doença. Existe um único relato sobre um estudo clínico que deverá se iniciar em breve com a terapia gênica em seres humanos, na distrofia muscular tipo cinturas.

 

 

 

 

 

 

 

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