Últimas Notícias - Pesquisas em animais ou in vitro

USA - Pesquisa financiada pela MDA-USA  desenvolve em laboratório uma espécie de camundongo geneticamente modificada, capaz de produzir mIgf1 (muscular insulin like growth factor 1). Esta proteína é  normalmente produzida por jovens, músculos sadios e estimula o crescimento muscular e a regeneração. Níveis elevados de mIgf1 durante toda a vida capacitam as células musculares se recuperar de agressões que normalmente causariam danos permanentes. Como na distrofia muscular a idade se acompanha de perda muscular e prejuízo na capacidade de recuperação dos músculos lesados. Especula-se sobre a possibilidade de uso desta proteína em camundongos com distrofia.

http://www.nature.com/cgi-taf/dynapage.taf?file=/ng/journal/v27/n2/index.html

http://www.mdausa.org/news/010130supermice.html

Pesquisadores conseguem corrigir a mutação de ponto em camundongos distróficos com a infusão do chamado anti-sense oligoribonucleotídeo Australia - Pesquisadores da University of Western Australia conseguiram com a infusão do anti-sense oligoribonucleotídeo corrigir a mutação de ponto de camundongos portadores de distrofia muscular; a distrofina produzida é mais curta que a normal mas provavelmente funcionante; o efeito seria semelhante ao da gentamicina; novos estudos serão feitos com maior número de animais para testar a efetiva função da distrofina. 

A pesquisa foi publicada em Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 98, Issue 1, 42-47, January 2, 2001.

http://www.mdausa.org/news/010321coaxingcells.html

Aumento da expressão da  alfa7ß1  integrina reduz a distrofia muscular e restaura a viabilidade de ratos distróficos

Illinois, USA - Pesquisadores   patrocinados  pelo MDA-USA, Burkin, Wallace, Nicol, Kaufman e Kaufman ([email protected]) descobriram que aumento da alfa7beta1 integrina pode prevenir o desenvolvimento de distrofia muscular em camundongos; em artigo publicado em 19/03/2001 (J.Cell.Biol. 152(6):1207-18,2001) os cientistas produziram geneticamente camundongos sem distrofina e utrofina que desenvolveram forma severa de distrofia muscular; alguns destes animais foram modificados para produzir uma quantidade extra de integrina e apresentarem-se sadios com aumento da força muscular, ausência de deformidades e aumento da sobrevida. Esta pesquisa pode abrir um novo caminho para descoberta de tratamentos ou novas formas de terapia gênica. Veja o vídeo dos animais deste experimento  vídeo

USA -  Pesquisadores de Cleveland estudaram o tetraelieloamonio  (TEA) em dois modelos de camundongos com distrofia (deficientes em distrofina e em mertosina). Nos dois modelos os pesquisadores encontraram aumento da força de contração muscular (efeito inotrópico).

http://www.ncbi.ntlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?cmd=Retrieve&db=PubMed&list_uids=11282391&dopt=Abstract

Melbourne -  Pesquisadores do Melbourne Neuromuscular Research Institute inseriram DNA normal em células musculares de camundongos com distrofia e conseguiram corrigir o defeito genético. Esta pesquisa realizada por Robert Kapsa e cols foi publicada em abril na revista Human Gene Therapy. Eles dispenderam 18 meses estudando as mutações do gene da distrofina. Neste experimento eles introduziram uma cópia do gene da distrofina em camundongos portadores do defeito genético. Através do processo denominado recombinação homóloga 15 a 20% das células afetadas  se tornaram normais. Esta mesma técnica foi tentada em portadores de fibrose cística mas com resultado de apenas 1% de correção das células. Em entrevista em 22/02/2001 Kapsa revelou que seu objetivo é obter stem cells (células tronco) de portadores de distrofia muscular, corrigi-las em laboratório e reinfundí-las nos pacientes esperando que elas se desenvolvam em músculos sadios com mínima chance de rejeição. Para ele o completo sucesso da pesquisa tem três etapas que precisam ser aprimoradas: correção da mutação genética, obtenção das células tronco e infusão das mesmas e sua transformação em músculos sadios. A primeira etapa já foi realizada mas é necessário que se consiga corrigir a totalidade das células e não só 15 a 20% delas. A segunda  e a terceira também já foram realizadas experimentalmente  mas a transformação em células musculares sadias ocorreu em proporção pequena.

http://www.abc.net.au/news/science/health/2001/02/item20010222084843_1.htm (com áudio da entrevista)

http://www.mda.org.au/research/generepair.html

USA - Pesquisa realizada na Purdue University, utilizando dois tipos diferentes de vírus, desenvolveu um sistema mais estável de transferência de material genético; está novo sistema poderá ser utilizado em doenças genéticas, câncer, diabetes, etc..

http://news.uns.purdue.edu/UNS/html4ever/010323.Sanders.delivery.html

-Terapia gênica restaura a visão de cães com cegueira genética

Pensilvânia -  na pesquisa publicada na Nature Genetics uma versão canina da amaurose congênita de Leber foi tratada unilateralmente com a administração do gene levado por um vetor viral; após quatro meses os animais apresentaram melhora significativa da o no olho tratado.

http://www.msnbc.com/news/565442.asp#BODY

http://www.cnn.com/2001/HEALTH/conditions/04/27/vision.restored.ap/index.html

http://www.nature.com/ng/

- Pesquisa contribui para a melhoria da terapia genética 

New Orleans - pesquisa realizada pela Universidade do Estado da Lousiana contribui para a melhoria da transferência de genes para as células alvo.

http://www.jbc.org/cgi/reprint/M010318200v1.pdf

- Descobertas confirmam potencial de cura das células embriônicas

New York Times - Cientistas publicaram artigos na sexta-feira (27) sobre dois grandes avanços no uso de células embriônicas para regenerar tecido humano. Em um dos artigos, biólogos dos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) utilizaram células-tronco embriônicas de camundongos para gerar órgãos produtores de insulina que se parecem com ilhotas de Langerhans pancreáticas. É um feito promissor para o tratamento de diabete do tipo 1, também conhecida como diabete juvenil. Elas não produziram insulina o bastante para curar os camundongos; McKay acredita que mais trabalho será necessário para amadurecer as células.

Em outro artigo, biólogos da Universidade Rockefeller provaram, em princípio, o conceito estranho, uma vez futurista, chamado de clonagem terapêutica, em camundongos. A idéia é tirar uma célula de pele comum de um paciente, convertê-la em embrião e usar as células embrionárias para reparar qualquer tecido do corpo do paciente. O embrião é destruído no processo.Neste caso, os pesquisadores da Rockefeller cortaram um décimo de polegada dos rabos de camundongos e converteram as células da pele do rabo em células-tronco. Colaboradores do Centro de Câncer Memorial Sloan-Kettering então fizeram as células-tronco tomarem a forma de células do cérebro, produtoras de dopamina, que são perdidas na doença de Parkinson. Ambos os estudos foram publicados na edição de sexta-feira da revista Science.

Injeção intraarterial de stem cells derivadas de músculos restaura a distrofina em camundongos com distrofia

Itália - pesquisa publicada demonstra que stem cels derivadas de músculos aderem aos capilares dos músculos e participam da regeneração de células lesadas.

http://www.jcb.org/cgi/content/abstract/152/2/335

USA - Estudo publicado na revista Cell de 4/5/2001 reforça a potencialidade do uso de stem cells. Células da médula óssea de camundongos  machos foram multiplicadas em laboratório e inocula das em  camundongos fêmeas anteriormente irradiadas. Após um ano do experimento estas células foram encontradas em pulmões, pele, intestino, etc. provando a sua capacidade de transformação em qualquer tecido. Este estudo é muito importante para estimular as pesquisas com estas células visto que os estudos iniciais foram realizados com embriões e há uma pressão negativa muito grande nos Estados Unidos com estas pesquisas.

http://www.cnn.com/2001/HEALTH/05/04/stem.cells.ap/index.html

http://www.msnbc.com/news/568385.asp#BODY

http://www.cell.com/current.shtml

        Três novos artigos, destinados a especialistas, relatam detalhes da terapia gênica por vetor viral:

http://www.gtmb.org/PDFVolume6/01Zink.pdf

http://www.gtmb.org/PDFVolume6/02Lundstrom.pdf

http://www.gtmb.org/PDFVolume6/03Bode.pdf

Austrália - leia e ouça a entrevista de Bob Williamson, Professor da Universidade de Melbourne, sobre as possibilidades da terapia gênica. A Austrália tem um centro  (Australian Neuro-Muscular Research Institute) que está pesquisando a terapia gênica para desenvolver um tratamento para a distrofia muscular de Duchenne.

http://www.abc.net.au/worldtoday/s283632.htm

Seattle -  Em Congresso que está ocorrendo de 30 de maio a 3 de junho de 2001 são relatados pelo menos 19 trabalhos de um total de mais de 1150 abordando a terapia gênica com vetores virais no tratamento da distrofia muscular. Esta linha de tratamento é considerada internacionalmente como a mais promissora no tratamento das distrofias musculares. O sistema imune é considerado um obstáculo ao sucesso desta terapia. Em um estudo de Jeffrey Chamberlain e seu grupo da Universidade de Washington em  Seattle construiram um vetor sem as proteínas que podem desencadear as respostas imunológicas denominado "gutted" adenovirus. Usando camundongos portadores de distrofia muscular observaram que o vetor com o gene da distrofina provoca uma mínima resposta imune; os genes são liberados para os músculos e provocam melhora da força muscular. Em outro estudo os autores desenvolveram micro-distrofinas com cerca de um terço do tamanho da distrofina completa e observaram, em camundongos, melhora da força muscular inclusive do músculo diafragma. Outro estudo independente da Universidade de Pittsburgh realizado por Xiao-Xiao e colaboradores  eles demonstraram, em camundongos, que após sete meses da aplicação do minigene da distrofina  (a última notícia desta página) o músculo apresenta força significativa maior do que o que não recebeu o tratamento com expressão da distrofina entre 20 e 50%. Leia os resumos completos dos artigos relacionados a distrofia muscular

Today's Findings From the ASGT Annual Meeting: New Cardiovascular Gene Therapy And New Gene Therapy Research for Muscle and Connective Tissue Disease

http://www.mdausa.org/research/010602_progressgenetherapy.html

http://www.mdausa.org/research/010601_dmdminigene.html

Nesta semana quatro pesquisas relatam avanços com a terapia gênica em outras doenças genéticas:

Cardiomiopatia dilatada - hamsters com deleção da delta sarcoglican(SG) e que não expressam a alfa, beta e gama SG foram tratados com injeção intramural no miocárdio de vetor viral contendo o gene normal delta SG com melhora clínica e funcional.

Fenilcetonúria -  trabalho realizado pela Universidade da Flórida em camundongos conseguiu reverter esta doença com  a  injeção de vetor viral contendo o gene responsável pela correção do distúrbio metabólico.

Deficiência de Arilsulfase A - usando stem cells em camundongos com a injeção do gene por vetor viral  pesquisadores alemães conseguiram corrigir o distúrbio metabólico e algumas alterações neurológicas, sem melhoras histológicas.

Hemofilia A - seis pacientes portadores de hemofilia A foram tratados com a implantação de fibroblastos retirados da pele e corrigidos em laboratório com plasmídeos com correção parcial do distúrbio e sem complicações após 12 meses do experimento. 

USA - pesquisa do Baylor College of Medicine (Houston,Texas), patrocinada pela MDA, demonstrou regeneração de vasos e do músculo cardíaco com a utilização de stem cells em um modelo experimental de isquemia miocárdica; os autores discutem as possibilidades de utilização das células tronco em doenças neuromusculares.

http://www.mdausa.org/news/010629stemcells_miceheart.html

Leia o artigo completo

Arizona - pesquisa patrocinada  e divulgada pela MDA demonstra um importante passo em um tratamento que pode salvar vidas de portadores de distrofia muscular. Como é sabido a perda da função muscular respiratória é uma importante causa de morte em portadores de distrofia.  Leaf Huang e colaboradores da Universidade de Pittsburgh obtiveram o primeiro sucesso na recuperação do músculo diafragma após a injeção intravenosa do gene da distrofina. Este pesquisador injetou o DNA, sem nenhum vetor, diretamente na veia do rabo do camundongo. Após a injeção ele fez uma cirurgia com clampeamento da veia que drena o sangue do diafragma criando uma pressão que empurrou o DNA para dentro do músculo. No sangue o DNA é rapidamente destruído mas todo este procedimento é rapidamente realizado antes desta degradação. Após o tratamento o diafragma apresentou expressão estável  do gene da distrofina por seis meses. Os músculos tratados resistiram a degeneração. Vinte e cinco por cento das células dos camundongos não tratados apresentaram degeneração, contra 2 por centro dos tratados após uma semana do tratamento. A técnica precisa ainda ser exaustivamente testada em animais e com modificações poderá um dia ser utilizada em seres humanos.

http://www.mdausa.org/news/010627dmd_respiratory.html

USA - pesquisa publicada na revista Science há dois dias alerta para o risco do uso das células tronco em clonagem de animais; pesquisas realizadas em camundongos demonstram alterações físicas tardias nos animais clonados tais como aumento de peso.

http://www.msnbc.com/news/596691.asp#BODY

http://www.cnn.com/2001/HEALTH/07/06/stemcells.cloning.ap/index.html

 

Itália - pesquisa do Instituto Theleton para a terapia gênica não conseguiu resultados em um modelo experimental de distrofia muscular em ratos.

Iowa (USA) - pesquisa divulgada esta semana demonstra que a utilização de um vetor modificado (rAAV-2cap5 - AAV-2 genomes pseudo-packaged into AAV-5 capsids) pode contribuir eficientemente para a melhoria dos resultados da terapia gênica usando vetores virais.

Holanda - pesquisa realizada em laboratório com células musculares obtidas de portadores de distrofia muscular de Duchenne conseguiu aumentar a produção de distrofina em até 75% dos miotubos utilizando a técnica de mRNA (antisense). O estudo mostra uma das linhas que estão sendo estudadas para corrigir o defeito genético.

Israel - Lior Gepstein e colaboradores conseguiram em laboratório transformar células embrionárias em células musculares cardíacas em todas as suas características, físicas e funcionais. O trabalho estará sendo publicado na revista "The Journal of Clinical Investigation"

http://www.iwon.com/home/news/news_article/0,11746,150489|top|08-01-2001::00:40|reuters,00.html

 http://news.independent.co.uk/uk/science/story.jsp?story=86559

http://www.msnbc.com/news/608399.asp

http://www.sciam.com/news/080101/1.ht

Taiwan - Pesquisa do Departamento de Neurologia de Taiwan estudou o efeito de ervas chinesas (liu-wei-di-huang-wan,LDW, e san-lin-pai-tsu-san,SPS) em camundongos com distrofia muscular. Eles demonstraram benefícios na atividade motora medida pelos parâmetros atividade horizontal, distância total, número de movimentos, tempo de movimentos, atividade vertical, número de movimentos verticais, tempo de moovimentos verticais, número e tempo de movimentos esteriotipados. Eles concluem que estas ervas podem ter um potencial para tratamento farmacológico das distrofias musculares.

Paris - Estudo realizado em modelos experimentais de distrofia observa resultados positivos na terapia gênica com a eletrotransferência de DNA livre. No entanto há completa rejeição após 3 meses ou 10 meses (respectivamente sem imunossupressão ou com imunossupressão).

USA - pesquisores da Universidade de Ohio desenvolveram um teste, denominado DOVAM, que aumenta a positividade de diagnóstico das mutações nas distrofinopatias para mais de 90%; os testes convencionais tem positividade de  cerca de 60 a 65% dos casos. O teste que custa U$ 1350 irá reduzir o número de casos que necessitarão de bíopsias musculares.

http://www.mdausa.org/news/010831betterDNAtest.html

http://www.neurology.org/cgi/content/abstract/57/4/645

Suiça - pesquisa publicada nesta semana na Revista Nature ( 413,302-7,2001) demonstrou que o uso de minigene de agrin, uma proteína conhecida por seu papel na formação da junção neuromuscular,  corrige a patologia muscular de camundongos num modelo experimental de distrofia muscular congênita; este mini-agrin se liga a alfa distroglican, uma proteína da membrana muscular. A ligação promove estabilização da alfa distroglican  e da laminina. Os autores concluem com este estudo que o uso de uma proteina não homologa em combinação racional com proteína da membrana pode ser uma ferramenta para restaurar a função de músculos distróficos.

http://news.bmn.com/jscan/biotech?uid=16651

http://www.mdausa.org/research/010921_genetherapyCMD.html

Curitiba (Paraná) - pesquisadores da Divisão de Doenças Neuromusculares da Universidade Federal do Paraná (Brasil) publicam artigo em Am J Med Genet 2001 Oct 1;103(2):115-20 analisando resultados de 48 pacientes com distrofinopatias comparando resultados obtidos com a determinação da deleção pela PCR nos tecidos e imunohistoquímica.

Los Angeles (USA) - trabalho divulgado hoje contribui para entender as alterações musculares na distrofia muscular. Os autores propõem que o maior dano muscular decorrente da ausência de distrofina se deve a ação dos macrófagos. A distrofina forma um complexo com inúmeras outras proteínas incluindo a óxido nítrico sintetase (NOS). Em músculos deficientes de distrofina como no modelo mdx em camundongos, a expressão de NOS é diminuida. Considerando-se que a perda da atividade anti-inflamatória do óxido nítrico pode exacerbar a perda muscular os autores introduziram um gene para produzir níveis normais de NOS em camundongos distróficos. Estes camundongos tiveram redução da concentração de  macrófagos nos músculos e prevenção da maioria das alterações musculares. A depleção de macrófagos por anticorpos neste modelo experimental semelhantemente reduz a agressão muscular. O presente estudo mostra que a ausência de distrofina é o gatilho que deflagra mecanismos patogênicos de agressão muscular. A consequente redução de NOS leva a um infiltrado de macrófagos e a perda muscular. Os autores estão estudando estes efeitos em outros modelos experimentais e estarão iniciando estudos clínicos com drogas anti-inflamatórias em pacientes com distrofia muscular.

músculos de camundongos distróficos (mdx) (imagem acima)  ficando menos desorganizados com a introdução de NOS (imagem abaixo) 

http://www.jcb.org/cgi/content/full/155/1/10

Califórnia - mais de 40 trabalhos apresentados no Congresso abordam temas relacionados a diferentes formas de distrofia; alguns trabalhos foram produzidos no Brasil. A maioria deles tem interesse exclusivo para especialistas ou pesquisadores; de qualquer modo para ler os  resumos click aqui

http://www.faseb.org/genetics/ashg/meet-2001/2001meetmenu.htm

Significado clínico da medida do fator de necrose tumoral alfa (TNF alfa) (01/11/01)

Japão - o autor deste estudo desenvolveu um método para dosagem do fator de necrose tumoral alfa, um importante mediador em doenças inflamatórias e auto-imunes. A média obtida em portadores de distrofia muscular foi 1000 vezes superior ao obtido em indivíduos sadios.

San Diego - este encontro, que se realizará de 10 a 15 de novembro de 2001, disponibiliza online os resumos a serem apresentados; alguns dos selecionados estão disponíveis  aqui; o mais significativo é sobre o transplante de medula óssea em um modelo experimental de distrofia em camungongos realizado na China.

http://sfn.scholarone.com/

França - existem muitos artigos recentes tentando esclarecer como ocorre a lesão muscular nas distrofias; neste estudo, realizado em Caenorhabditis elegans, um tipo de parasita, os autores observaram que o aumento da atividade dos canais de cálcio e o aumento do cálcio intracelular aumenta dramaticamente o grau de degeneração muscular

Inglaterra -  como explicamos no ítem tratamento deste site (recentemente atualizado) o aumento da expressão da utrofina, uma proteína muito similar a distrofina,  é uma alternativa como tratamento da distrofia muscular; no entanto há um receio de que a super expressão do gene em todo o organismo possa causar efeitos danosos o que inviabilizaria o tratamento genético por via sistêmica (em todo o organismo) num artigo a ser publicado no próximo número da revista Neuromuscular Disorders os autores analizaram a expressão da utrofina em vários tecidos num modelo experimental em camundongos (mdx mouse). Os resultados mostraram que não houve efeitos tóxicos da super expressão da utrofina.

USA - estudo realizado na Universidade de Michigan observou que o oxigênio pode destruir as stem cells, retardar seu crescimento ou alterar seu desenvolvimento transformando stem cells precursoras de células musculares em tecido adiposo. As células mais primitivas são mais sensíveis ao oxigênio.

http://www.cosmiverse.com/science11080105.html

http://www3.interscience.wiley.com/cgi-bin/abstract/85511764/START

USA -  anunciado em 15/11/01 que a AxCell Biosciences (http://www.axcellbio.com), subsidiária da  Cytogen Corporation (http://www.cytogen.com) assinou um termo de cooperação com a  Mount Sinai School of Medicine para a pesquisa de proteínas envolvidas no desenvolvimento da distrofia muscular visando indicar drogas que possam ser efetivas no tratamento desta doença e de outras doenças neuro-degenerativas. As pesquisas serão conduzidas por Marius Sudol, professor associado do Mount Sinai Medical Center.

USA - de 8 a 12 de dezembro de 2001 realizar-se-á em Washington está reunião de especialistas em pesquisa experimental. Alguns trabalhos envolvem pesquisas  com stem cells, distrofia muscular, etc. Com 20 dias de antecedência disponibilizamos 22 resumos do Congresso (em inglês).

Japão - oligonucleotídeos tem sido pesquisados como forma de tratar portadores de distrofia com deleção do gene (cerca de 2/3 dos pacientes); este tratamento permitiria a transcrição da distrofina, pulando o bloqueio do gene defeituoso; neste experimento os pesquisadores da Universidade de Kobe realizaram uma biópsia muscular de um voluntário consentido portador de distrofia muscular de Duchenne com deleção no exon 20. As células foram cultivadas. A análise do músculo mostrou que não havia distrofina. As células receberam oligonucleotídeos. Estudos realizados nos dias subsequentes constataram a produção de distrofina pelas células após este tratamento. Os pesquisadores já tem projeto de realizar a pesquisa in vivo com portadores de distrofia, já havendo aprovação por comitê de ética em pesquisa para sua realização. Neste mesmo trabalho os pesquisadores citam um outro grupo da Holanda que realizou concomitantemente a mesma pesquisa utilizando células musculares de dois portadores de distrofia muscular de Duchenne com deleção no exon 45 e obtiveram um resultado positivo semelhante.

USA -  pesquisa realizada concomitantemente na  University of  Wisconsin-Madison e da University of Bonn Medical demonstrou em camundongos que stem cells (células tronco) embrionárias puderam ser direcionadas para se desenvolver como células do sistema nervoso (neurônios e astrócitos). Esta pesquisa abre caminho para aperfeiçoamento desta técnica para ser usada em doenças da medula espinhal e da doença de Parkinson.

http://unisci.com/stories/20014/1203011.htm

http://www.msnbc.com/news/665453.asp?0si=-

USA -  Importante pesquisa patrocinada pela MDA  foi anunciada hoje numa conferência de Johnny Huard na 41a Reunião Anual da Sociedade Americana de Biologia Celular em Washington; pela primeira vez usou se a combinação de células tronco e terapia gênica para corrigir parcialmente as alterações musculares de camundongos portadores de uma forma de distrofia muscular de Duchenne. Em uma série de experimentos Huard e colaboradores da Universidade de Pittsburgh isolaram stem cells  de músculos de camundongos portadores de distrofia, as cultivaram e as corrigiram em laboratório com a introdução do gene da distrofina; as stem cells foram introduzidas nos camundongos que passaram a ter  células musculares com distrofina-positiva. 

Segundo Sharon Hesterlee, diretor da MDA, uma forma de terapia semelhante pode ser usada em seres humanos, minimizando os problemas de rejeição. 

Neste experimento as células tronco utilizadas tinham alta capacidade de regenerar as células musculares lesadas. Após isoladas as stem cells foram infectadas por um virus carregando uma minidistrofina, uma versão miniaturizada da distrofina desenvolvida por Xiao Xiao da mesma Universidade ( notícia já descrita anteriormente neste site), e que em outros estudos já demonstrou a capacidade de regenerar as células musculares da mesma forma que a versão integral da distrofina. 

Em um estudo eles injetaram as células tronco por via venosa nos camundongos que tiveram sua medula óssea destruida. Estas células regereraram a medula óssea e algumas delas se dispersaram nos músculos e  órgãos. Em outro estudo eles transplantaram as células tronco diretamente no músculo.

 Infelizmente nos dois modelos estudados ele não conseguiu gerar fibras suficientes  com distrofina positiva para produzir efeitos terapêuticos. No entanto o pesquisador se mostra otimista com a possibilidade de melhorar o procedimento e esta consultando o FDA sobre a possibilidade de realizar estudos clínicos em portadores de distrofia muscular de Duchenne. A pesquisa foi considerada muito importante e promissora, demosntrando um importante caminho para a cura da doença.

http://www.mdausa.org/news/011210stemcellDMD.html

USA - pesquisa publica na revista Science (14/12/2001) utilizou a terapia gência para corrigir uma forma experimental de anemia falciforme de camundongos; a correção genética foi realizada em células obtidas de amostras da medula óssea dos animais; foram utilizados retrovírus para levar a proteína deficiente; as células corrigidas foram inoculadas em camundongos doentes que tiveram sua medula óssea irradiada; a expressão do gene continou por pelo menos 10 meses em todos os camundongos em mais de 99% dos glóbulos vermelhos circulantes; mais de 52% da hemoglobina incorporou esta proteína, evitando alguns dos agravos que este tipo de anemia desencadeia.

http://www.sciencedaily.com/releases/2001/12/011214081241.htm

http://www.newscientist.com/news/news.jsp?id=ns99991690

http://www.cnn.com/2001/HEALTH/conditions/12/14/sickle.cell.therapy.reut/index.html

 

Suiça - este estudo experimental confirma outros estudos clínicos que demonstram os benefícios da suplementação de creatina em portadores de distrofia. 

USA - Avigen (http://www.avigen.com)  empresa auto-denominada de líder na área de desenvolvimento de produtos para terapia gênica recebeu autorização para prosseguir os estudos clínicos visando tratar a hemofilia B, uma doença genética que desencadeia hemorragias, com vetores virais. Os estudos iniciais mostraram que a técnica é segura e será testada em número maior de portadores para avaliar resultados 

http://www.avigen.com/coinfo/press/press_Approval_to_continue_trial_121901.htm

USA - pesquisa  realizada no Beith Israel Deaconess Medical Center  demonstrou os benefícios do uso de stem cells em animais com insuficiência cardíaca em decorrência de infarto  do miocárdio. Os ratos  foram analisados 6 semanas após  receber células tronco na área do coração doente; as células sobreviveram nesta área do coração e reduziram o tamanho da área lesada além de melhor o desempenho funcional do coração.

USA -  pesquisa da Harvard Medical Institute e Mc Lean Hospital publicada em "Proceedings Of the National Academy of Sciences" desta semana demonstrou resultados positivos com o uso de stem cells na doença de Parkinson experimental de ratos. As células tronco embrionárias  foram injetadas no sistema nervoso e após 9 semanas se transformaram em neurônios e produziram dopamina, essencial para o tratamento da doença. Neste trabalho um inconveniente bastante importante foi identificado: 5 dos 19 animais estudados desenvolveram tumores.

http://news.bbc.co.uk/hi/english/health/newsid_1748000/1748928.stm

http://www.usatoday.com/news/healthscience/health/2002-01-07-parkinsons.htm

USA -  estudo recente publicado na Nature Genetics e realizado na "University of Washington" demonstrou experimentalmente que o uso de  AAV (adenovirus), utilizado como carregador de genes para a células, ocasionou deleção e outras alterações cromossomicas em células de câncer de animais; não há evidência comprovada que o vetor foi o responsável por estas alterações, mas há preocupação que estas alterações possam também ocorrer em células humanas

USA - pesquisadores americanos e japoneses conseguiram transformar células indiferenciadas em neurônios produtores de dopamina, que pode ser útil no tratamento da doença de Parkinson.

http://abcnews.go.com/sections/scitech/DailyNews/monkeycells020129.html

http://www.pnas.org/cgi/content/abstract/032662199v1

http://www.japantoday.com/e/?content=news&cat=4&id=193980

USA - reforçando o potencial das células tronco a empresa Advanced Cell Technology, que em novembro anunciou a primeira clonagem de embrião humano, anunciou que em uma pesquisa as células tronco de vacas foram transformadas em um "mini rim"; estas  células renais produziram urina.

http://www.newscientist.com/news/news.jsp?id=ns99991855

http://www.cnn.com/2002/HEALTH/01/31/cloned.kidney.ap/index.html

http://www.thestar.com/NASApp/cs/ContentServer?pagename=thestar/Layout/Article_Type1&c=Article&cid=1012345868477&call_page=TS_World&call_pageid=968332188854&call_pagepath=News/World&col=968350060724

http://www.nytimes.com/2002/01/31/health/31CLON.html?ex=1013317200&en=8bea6aa5736926d1&ei=5040&partner=MOREOVER

USA - pesquisa da  Wake Forest University School of Medicine (Carolina do Norte) e Advanced Cell Technology (a empresa responsável pela clonagem do primeiro embrião humano) obteve stem cells  a partir de um óvulo não fecundado  num processo denominado partenogênese. A pesquisa foi realizada em macacos e foi publicada na revista Science.

http://www.newscientist.com/news/news.jsp?id=ns99991871

http://chicagotribune.com/news/nationworld/chi-0202010330feb01.story?coll=chi%2Dnewsnationworld%2Dhed

http://www.siliconvalley.com/docs/news/svfront/071327.htm

http://www.dallasnews.com/health/stories/stemcell_01nat.ART0.Zone1.Edition1.a2e9e.html

http://www.nytimes.com/2002/02/01/science/01CELL.html?ex=1013317200&en=b95ccac80b6c6037&ei=5040&partner=MOREOVER

Neste artigo de revisão os autores australianos fizeram uma revisão dos estudos em pacientes e experimentais que demonstrem alterações cerebrais na distrofia muscular de Duchenne. Estudos de comportamento demonstraram que os portadores de Duchenne apresentam alteração da cognição e redução do QI (quociente de inteligência) (média de 85) e os camundongos com  o modelo experimental aprentam prejuizo do reflexo de fuga e da memória recente. Em  meninos com Duchenne alterações da arquitetura do SNC foram observadas, com anormalidades em denditros e perda de neurônios. A análise nos camundongos mostra redução no número de neurônios, com redução dos canais de GABA A (neurotransmissor). Há também descrição de alterações bioenergéticas (em pacientes e experimental). Alterações no ECG e na eletrofisiologia de camundongos também é descrita demonstrando que a ausência ou redução da distrofina também se reflete no sistema nervoso central.

http://brain.oupjournals.org/cgi/content/abstract/125/1/4

USA - através de inquérito realizado nos USA os pesquisadores encontraram que 28% dos geneticistas não conseguiam repetir os experimentos de outros autores por falta de informações fundamentais.

http://jama.ama-assn.org/issues/v287n4/abs/joc11433.html

Japão - uma preocupação das pesquisas com células tronco é que elas se transformem em células adultas com as mesmas características funncionais das células em que se transformaram. Nesta pesquisa in vitro as células tronco tratadas com 5-azacitidina se transformaram em células musculares cardíacas (cardiomiócitos). O estudo revelou que após a transformação em células musculares elas passaram a expressar receptores característicos do músculo cardíaco (beta 1 e 2, muscarínico 1 e 2). Este estudo é importante por mostrar que as células transformadas serão funcionalmente eficazes.

http://circ.ahajournals.org/cgi/content/abstract/105/3/380

 

França - o aumento da expressão da utrofina é uma alternativa para um tratamento definitivo ou paliativo da distrofia muscular de Duchenne; há evidências que a utrofina possa exercer as mesmas funções da distrofina. O locus da utrofina é no cromossomo 6 humano e 10 do camundongo; as semelhanças entre a distrofina e a utrofina faz crer que derivam de um gene ancestral comum. No homem e no camundongo a utrofina é observada na superfície das membranas de células imaturas e é progressivamente substituida pela distrofina exceto na junção neuromuscular onde ela persiste. Portanto o encontro de drogas ou moléculas que aumentem a expressão da utrofina seria importante na terapia. As vantagens seriam: a) não haveria necessidade de  substituição do gene já que o gene da utrofina já esta presente; b) as reações imunológicas poderiam ser mínimas. No momento só duas moléculas que se expressam na junção neuromuscular, neural agrin e heregulin, mostraram capacidade de aumentar a expressão da utrofina no citoplasma e os níveis de mRNA utrofina, respectivamente, em cultura de células. Uma proteína que se liga a distrofina e utrofina, a sintrofina, é associada a uma enzima  óxido nítrico sintetase. Neste trabalho os autores conseguiram demonstrar o aumento da distrofina em células musculares de camundongos normais e em portadores de uma forma experimental de distrofia muscular tratados com L-arginina (um doador de óxido nítrico através da oxido nítrico sintetase). Os autores concluem que o uso de drogas podem aumentar significantemente a utrofina na célula muscular e contribuir para um tratamento paliativo da distrofia muscular.

USA - algumas dificuldades técnicas tem retardado as pesquisas com terapia gênica na distrofia muscular (escolha do vetor, tamanho do vírus, etc). Neste estudo os pesquisadores analisaram a viabilidade do uso do vírus do herpes simples tipo 1 como vetor, isto é, para levar o gene da distrofia para as células musculares. Os resultados demonstraram expressão baixa do gene (entre 10 e 50% da células) com pequena reação inflamatória. Os autores concluem que o referido vírus é promissor como vetor do gene da distrofia muscular.

USA - utilizando um modelo experimental em hamster de doença do músculo cardíaco (por deficiência de delta sarcoglican) os pesquisadores utilizaram a terapia gênica com o adenovirus preparado com a proteína deficiente. Após 3 semanas do tratamento os pesquisadores encontraram a presença da proteína em porcentagem grande de fibras e uma redução da disfunção do miocárdio. 

Inglaterrra –  este grupo de pesquisadores já havia demonstrado que fibroblastos retirados da derme e injetados em músculos em um modelo experimental em ratos de distrofia muscular não só participavam da formação de novas miofibras como expressavam a proteína distrofina. E que um fator presente no meio de cultura favoreceria a transformação; este fator foi descrito como sendo a galectina 1.  No presente trabalho eles confirmam a presença de galectina-1 no meio usado para conversão. A exposição a galectina-1 in vitro resulta em 100% de conversão dos fibroblastos. Em um outro trabalho do grupo eles consideram a galectina 1 como uma arma importante para ser utilizada em experimentos de terapia gênica da distrofia muscular. Para saber mais sobre a galectina 1 clique aqui.

Nesta semana o Dr Michael Chopp do Henry Ford Health Science Center (Detroit, Michigan)  em uma palestra no 27o  Congresso Internacional da Associação Americana do AVC descreveu os resultados positivos com o uso do viagra em animais com derrame cerebral experimental. Após a palestra ele revelou a Reuters  (http://www.reutershealth.com/frame2/arch.html) que o viagra poderia ser usados em várias doenças neurodegenerativas como o Parkinson e a distrofia muscular. Esta declaração repercutiu na imprensa que desconhecia esta possibilidades de utilização do viagra. O Viagra, cujo nome químico é sildenalfil, é o medicamento mais vendido no Brasil e um dos mais vendidos no mundo. Ele foi sintetizado como droga para atuar em doenças cardíacas, como a insuficiência cardíaca ou angina, mas nos testes realizados ele mostrou efeito mais promissor no tratamento da impotência sexual e para esta finalidade ele tem sido prescrito. Por seu mecanismo de ação ele aumenta o óxido nítrico, que é um mediador envolvido em várias atividades celulares. Em tese, todas as doenças nas quais o aumento do óxido nítrico na célula é benéfico poderiamos utilizar o viagra. Assim ele tem sido experimentado no tratamento de outras doenças clínicas como a hipertensão pulmonar. Vários trabalhos tem demonstrado o importante papel do óxido nítrico no aumento da expressão da utrofina e relacionando a sua ausência com muitas alterações da estrutura da célula muscular em portadores de distrofia. Neste sentido muitos dos tratamentos paliativos atuam aumentando os níveis do óxido nítrico como a L-arginina. Portanto o uso do Viagra na distrofia tem a sua lógica e poderia ser mais um produto no arsenal de tratamentos paliativos. Não encontramos na literatura nenhum trabalho descrito com este uso mas é provável que possa já estar sendo testada em animais. Um dos grandes impedimentos do uso desta droga é o seu custo que é bastante elevado.

http://scienceweek.com/search/sworevi.htm

http://www.pnas.org/cgi/content/full/95/25/14592

USA - Escolar e colaboradores tem estudado em modelos experimentais drogas que podem atuar retardando a evolução da distrofia muscular. Neste estudo de mais de 50 drogas muitas se mostraram promissoras. Com o avanço dos conhecimentos sobre as alterações que ocorrem na distrofia muscular fica mais fácil identificar como as drogas atuam nesta situação e pesquisar os seus efeitos em seres humanos. Neste relato ela mostra uma  relação das 10 drogas mais promissoras e faz um esquema de como ocorre as alterações no músculo e onde estas drogas atuam. Estas drogas serão as primeiras a serem testadas em seres humanos; os projetos que já se iniciaram foram os testes com a glutamina, a creatina, a coenzima Q10 e a oxatomida. A lista de drogas mais promissoras esta aqui e o esquema patofisiológico esta aqui.

USA - em entrevista a CNN sobre a possibilidade de utilização da terapia gênica para aumentar o desempenho muscular nos esportes o pesquisador Lee Sweeney da University of Pennsylvania Medical School revelou que estará pesquisando os efeitos do IGF-1 em cães com distrofia muscular. O IGF-1 (Insulin-like Growth Factor-One) é um fator produzido normalmente por animais. Em suas pesquisas experimentais ele desenvolveu um super-camundongo que recebeu gene para aumentar a produção de IGF-1. Este animal apresenta maior massa muscular e maior capacidade de regeneração muscular. O IGF-1 é um dos fatores estudados por Escolar como tratamento paliativo da distrofia muscular (notícia de 16/02/02).

http://www.cnn.com/2002/TECH/science/02/08/oly.igf1.research/index.html?related

http://www.cnn.com/2002/TECH/science/02/08/igf1.side/index.html

http://www.cnn.com/2002/HEALTH/diet.fitness/02/20/engineered.athletes/

USA -  neste trabalho já relatado em Congresso (ver em últimas notícias) os pesquisadores desenvolveram micro e minidistrofinas que mantem a mesma capacidade funcional da proteína integral. A administração de vetor viral com micro-distrofina em um modelo de distrofia em camundongos resultou numa impressionante reversão das alterações histológicas. Os resultados demonstram que as alterações patológicas da distrofia podem ser revertidas e prevenidas com a terapia gênica com micro-distrofinas. Para facilitar segue o resumo original em inglês:

Modular flexibility of dystrophin: Implications for gene therapy of Duchenne muscular dystrophy

Scott Q. Harper1, 2, Michael A. Hauser4, 5, Christiana DelloRusso1, 3, Dongsheng Duan6, Robert W. Crawford1, Stephanie F. Phelps4, Hollie A. Harper1, Ann S. Robinson4, John F. Engelhardt6, Susan V. Brooks3 & Jeffrey S. Chamberlain1, 2, 4

Attempts to develop gene therapy for Duchenne muscular dystrophy (DMD) have been complicated by the enormous size of the dystrophin gene. We have performed a detailed functional analysis of dystrophin structural domains and show that multiple regions of the protein can be deleted in various combinations to generate highly functional mini- and micro-dystrophins. Studies in transgenic mdx mice, a model for DMD, reveal that a wide variety of functional characteristics of dystrophy are prevented by some of these truncated dystrophins. Muscles expressing the smallest dystrophins are fully protected against damage caused by muscle activity and are not morphologically different from normal muscle. Moreover, injection of adeno-associated viruses carrying micro-dystrophins into dystrophic muscles of immunocompetent mdx mice results in a striking reversal of histopathological features of this disease. These results demonstrate that the dystrophic pathology can be both prevented and reversed by gene therapy using micro-dystrophins.

1. Department of Neurology, University of Washington School of Medicine, Seattle, Washington, USA
2. Program in Cellular & Molecular Biology, University of Michigan Medical School, Ann Arbor, Michigan, USA
3. Department of Physiology, University of Michigan Medical School, Ann Arbor, Michigan, USA
4. Department of Human Genetics, University of Michigan Medical School, Ann Arbor, Michigan, USA
5. Departments of Medicine and Ophthalmology, Duke University Medical Center, Durham, North Carolina, USA
6. Department of Anatomy & Cell Biology, University of Iowa School of Medicine, Iowa City, Iowa, USA
Correspondence should be addressed to J S Chamberlain. e-mail: [email protected]

 

Japão - o aumento da expressão da utrofina é uma alternativa muito pesquisada nas tentativas de cura da distrofia. Neste estudo os pesquisadores conseguiram aumentar a expressão da utrofina quando injetaram interleucina 6 no período neonatal em camundongos com uma forma experimental de distrofia muscular.

Atenção: interleucina é uma proteína produzida por células  denominadas linfócitos T-helper, um tipo de glóbulo branco. A produção de interleucina é realizada em situações de infecção e promove amadurecimento e multiplicação das células de defesa. É muito difícil de purificar e é muito cara.

USA - na edição de fevereiro de 2002 da revista Quest  há uma extensa reportagem sobre as pesquisas de Johnny Huard com terapia gênica na distrofia muscular. A seguir você lerá um resumo do artigo e verá um esquema traduzido sobre as possibilidades de uso das células tronco. ATENÇÃO: não é nossa intenção infringir direitos autorais de ninguém mas a tradução as vezes é necessária pela dificuldade de muitos pais em entender os artigos em inglês, especialmente com termos técnicos. Johnny Huard está pesquisando tratamentos para a distrofia muscular há 12 anos. No início ele fez experimentos com transplante de mioblastos que demonstraram nenhum efeito. Na década de 1990 as pesquisas se voltaram para as células tronco e na procura de substâncias que pudessem identificá-las e separá-las de outras células. Huard e outros cientistas tentaram identificar as células tronco em diversos tipos de tecidos. Usando seus conhecimentos antigos e as novas pesquisas ele identificou stem cells nos músculos com capacidade de regenerar o tecido muscular. Mioblastos tinham a capacidade de regenerar músculos em camundongos mas eram ineficáveis no homem. Voltando ao laboratório os cientistas descobriram que muitos mioblastos ficavam dormentes, outros eram destruídos pelo sistema imune e outros não produziam a distrofina. Através de muitos testes Huard conseguiu separar dos mioblastos uma porção de células com alto potencial miogênico (regenerar músculos). Através dos estudos dos marcadores de células tronco estas células foram identificadas como stem cell. Huard que atualmente trabalha no Hospital Infantil de Pittsburgh não foi o primeiro a identificar stem cells no músculo mas foi o primeiro a injetá-las nos músculos. Em suas pesquisas ele observou que as stem cells dos músculos podem continuar a produzir células muscular após seu transplante, que não apresentam algumas características de células adultas que poderiam levar a rejeição das mesmas pelo sistema imune e que produzem não somente fibras musculares mas também outras células que podem contribuir para a regeneração muscular (o que poderia ser benéfico em, fases mais avançadas da doença). Os esquemas propostos para o uso de células tronco estão aqui. Muitos cientistas temem que o uso de células alogênicas possa ocasionar reações imunes. Em sua mais recente pesquisa (já divulgada no site) e que será publicada em breve ele utilizou células tronco retiradas do músculo de camundongos portadores de distrofia, corrigiu em laboratório e as reinfundiu no músculo. Os resultados mostraram que algumas células passaram a produzir distrofina mas não houve recuperação funcional do músculo. Os transplantes alogênicos tem conseguido resultado na expressão da distrofina em 25% das fibras o que pode resultar em melhora funcional. A próxima etapa é realizar as pesquisas em grandes animais, observar se haverá risco de desenvolvimento de tumores, e se no ser humano o resultado será semelhante ao do  experimento animal. Apesar de achar que há necessidade de aprimoramento da técnica para usar em humanos ele fez uma consulta ao FDA (Food and  Drugs Administration) como preparação para os testes em pacientes com distrofia muscular de Duchenne.

USA - Este trabalho reforça a potencialidade das células tronco. Amostras de fígado, pele e trato gastrointestinas foram obtidas de 12 pacientes que receberam transplante de stem cells hematopoieticas  ou da medula óssea. Seis mulheres receberam transplante de homens, 5 receberam transplante do mesmo sexo e um transplante autólogo. Todas as mulheres que receberam transplantes de pessoas do sexo masculino apresentavam células do doador na pele e fígado. As células foram detectadas em intervalos que variaram de 13 a 354 dias.

USA - divulgado hoje o relatório do primeiro dia do Encontro de Especialistas, mais de 30, reunidos em Tucson, Arizona. Os trabalhos tem descrito que células da médula óssea podem migrar para o músculo. Muitos investigadores relataram ter isolado tipos  particulares de células da medula óssea e pelo menos um tipo de célula  no músculo que aparenta ser stem cell.  Em todos os estudos as células tronco que penetram no músculo é pequena necessitando algum estímulo químico ou irradiação. Os cientistas debateram a tarde outros usos do transplante de médula óssea e os resultados deste tratamento. No final do primeiro dia, o consenso dos especialistas é que mais estudos devem ser feitos para entender as bases biológicas da transformação de células tronco em músculos e outras questões sobre o transplante de medula óssea; este procedimento tem um risco considerável e até o momento um benefício questionável. Dentre as questões a serem exploradas estão:

USA - terminou de maneira frustante o encontro de Especialistas para debater as dificuldades e os nós que retardam as pesquisas em terapia gênica; no sábado os participantes divulgaram  um curta relação de coisas que devem ser feitas para que as células tronco possam ser utilizadas em estudos clínicos. Os estudos realizados em animais demonstraram que uma pequena quantidade de células musculares passa a expressar a distrofina após transplantes de células tronco. Perante os resultados experimentais considerados inexpressivos os benefícios do transplante de medula óssea são completamente desconhecidos disse William Tse do  Dana Farber Cancer Institute de Boston no início da sessão de sábado. Segundo Louis Kunker, descobridor do gene da distrofina e o primeiro a realizar transplantes de medula óssea em animais de experimentação no início dos anos 90, o uso de células da medula óssea tem potencial de causar mais malefícios  do que resultados positivos. No final da reunião a maioria dos pesquisadores foram concordantes que o transplante de células tronco precisa mostrar resultados positivos em animais antes de ser utilizado experimentalmente em seres humanos.

    As medidas propostas pelo grupo foram:

a) colaborar na descoberta dos sinais que aumentem a transformação de células tronco em músculos;

b) criar um protocolo para realizar biópsias musculares  em pessoas que receberam transplante de medula óssea por outras doenças hematológicas ou imunes (para tentar descobrir fatores que possam ter favorecido a transformação em células musculares);

c) fornecer ferramentas e animais que possibilitem pesquisas em distrofia muscular;

d) estabelecer um banco de dados computadorizado com informações sobre os defeitos genéticos que originam distrofia muscular no homem e animais;

e) investigar o uso do transplante de medula óssea em outras formas de distrofia muscular como a tipo cinturas e congênita.

USA - Este estudo em camundongos portadores de distrofia muscular experimental procurou determinar fatores envolvidos no estabelecimento da lesão muscular. O trabalho revelou uma coordenada ativação de inúmeros componentes inflamatórios (citocinas, adesão de leucócitos, etc). Estes resultados demonstraram alterações inflamatórias ainda não convenientemente estudadas e pode contribuir para o surgimento de tratamentos paliativos que podem retardar o desenvolvimento da doença. 

Canadá -  A reação imunológica ao transplante de mioblastos nos acometidos por Duchenne obriga o uso de imunossupressores sendo que  a tolerância imunológica reduz a necessidade destes imunossupressores (que tem efeitos colaterais). Neste estudo camundongos portadores de distrofia muscular experimental  receberam transplante de mioblastos no músculo tibial anterior. Sete dias antes  do transplante eles receberam transfusão de células esplênicas do doador e anti CD-154. Os animais apresentaram expressão da distrofina em 83, 60 e 20% respectivamente após 1, 3 e 6 meses do transplante.  Nenhum anticorpo contra o doador foi produzido em mais de 3 meses após o transplante. Entretanto abundante atividade de células citotóxicas foi observada em músculos, especialmente nas que apresentavam maior expressão da distrofina. Os autores concluem que o uso de transfusão específica do doador + anti-CD154 prolonga a sobrevida das células mioblásticas transplantadas, mas os animais que utilizaram este tratamento não desenvolveram tolerância imunológica às células transplantadas.

Suiça - O papel dos radicais livres na patogenia da Distrofia Muscular tem sido muito estudado. Neste trabalho foi utilizado o chá verde por 4 semanas em camundongos em um modelo experimental de distrofia muscular. O extrato de chá verde reduz significantemente e dose dependente a necrose das fibras musculares rápidas  mas até a dose testada não teve efeito nas fibras musculares lentas. O extrato de chá verde também diminui dose dependente o stress oxidativo em cultura de células. A dose mínima utilizada em camundongos corresponde a aproximadamente a dose de 1,4L de chá/dia em humanos. Os autores concluem que o chá verde em camundongos pode melhorar a saúde do músculo por redução ou retardo da necrose  por seu efeito antioxidante.

Denver (USA) - no período de 14 a 20 de abril de 2002 realizar-se-á em Denver o Congresso da Academia  Americana de Neurologia, o mais conceituado encontro de neurologistas dos USA. Dos 1541 artigos selecionei os que se relacionam a distrofia muscular, sendo vários abordam a  terapia gênica das distrofias, alguns sobre o acompanhamento clínico (corticóides, função pulmonar), genética, etc. Para ler os resumos em inglês clique aqui. 

USA - Pesquisa liderada por H Lee Sweeney da Universidade da Pennsylvania introduziu o gene da IGF-1 (fator de crescimento semelhante a insulina- 1) em camundongos com distrofia muscular experimental; IGF-1 é uma proteína presente no organismo normal mas camundongos normais que receberam este gene adquiriram maior massa muscular ("super-camundongos") e ficaram resistentes a perda muscular relacionada com a idade. Os resultados obtidos foram muito positivos: a massa muscular aumentou em até 40% com aumento da força muscular em relação aos camundongos portadores de distrofia que não recebeu o gene IGF-1. O músculo diafragma exibiu hipertrofia e hiperplasia em todas as idades observadas. Além disso a expressão da IGF-1 reduz significantemente a quantidade de fibrose observada no diafragma. Diminuição da mionecrose também foi observada no diafragma e no quadríceps. Por fim aumento da capacidade de regeneração e proteção celular foi obervado. Os autores concluem que o aumento da capacidade de regeneração e prevenção da necrose muscular pode ser um tratamento efetivo para os sintomas secundários a ausência da distrofina. Em complemento o pesquisador sugere que o uso de células tronco do paciente associado a introdução deste gene pode se constituir em um tratamento efetivo. Sharon Hesterlee da MDA sugere que está forma de tratamento pode ser utilizada em várias formas de distrofia.

http://www.mdausa.org/news/020401superMouseDMD.html

Londres - muitos estudos relatam que o tamanho do gene da distrofina é um fator complicador da terapia gênica da Distrofia Muscular de Duchenne; os pesquisadores neste trabalho construiram um vetor viral com um mini-gene da distrofina, utilizando o auxílio de um outro vírus promotor (CMV). Os camundongos receberam com 12 dias de vida o vetor viral diretamente no músculo o que resultou na expressão da distrofina em mais de 50% das fibras por mais de 20 semanas com restauração do complexo de proteínas associadas a distrofina na membrana celular. Além disso, inibição da degeneração das fibras musculares também foi observada.

 

Canadá e Alemanha - os vetores adenovírus (AdV) tem sido utilizados com sucesso na transferência de mini-genes em camundongos. Em muitos estudos, como o abaixo, o citomegalovirus é utilizado para aumentar a expressão da distrofina (promotor). Mais recentemente, uma versão curta da creatina kinase muscular (MCK1350) tem sido usada como promotora demonstrando um aumento da expressão do gene quando se utiliza o AdV. Neste estudo os pesquisadores criaram um vetor viral cuja expressão do gene será controlada pela MCK 1350. Este vetor foi injetado por via intramuscular no músculo tibial anterior em pouco tempo após o nascimento dos camundongos portadores de distrofia muscular experimental. Após 20 dia houve um aumento  do número de fibras que expressavam a distrofina. Após 60 dias houve um aumento significativo do número de fibras com distrofina positiva.

Alemanha e Suiça - Myo Contract Pharmaceutical Research, empresa especializada na pesquisa de drogas que poderiam ser utilizadas em doenças neuromusculares, anunciou no dia 5/4/02 uma associação com a MelTec GmbH, empresa especializada na pesquisa sobre proteínas. A MeltTec auxiliará na identificação dos mecanismos envolvidos na patogenia da distrofia e a Myo Contract irá desenvolver drogas para retardar a evolução da doença.

USA - Em um modelo experimental de distrofia muscular os pesquisadores procuraram corrigir o defeito genético com a utilização de oligonucleotídeos quiméricos. Os resultados demonstraram em cultura de células a expressão do gene da distrofina (1 a 15%). A injeção destes oligonucleotídeos no músculo de camundongos com distrofia também demonstrou resultado.

Austrália - notícia divulgada pela ABCNews Online em 9 de abril revela que o Dr. Andrew Hoey, da University of Southern Queensland (USQ) e da Australian Neuromuscular Research Institute na Western Australia tem realizado pesquisas para desenvolver um tratamento que permita as células ignorar as mutações genéticas, transformando a Distrofia Muscular de Duchenne em uma forma mais branda, a Distrofia Muscular de Becker. Nesta condição a doença evoluiria mais lentamente aumentando a sobrevida e a qualidade de vida. Já se divulgou em artigos científicos várias tentativas semelhantes mas o que chama atenção nesta reportagem é a frase que "os estudos iniciais provaram que há aumento da força muscular" que deve ser o objetivo de todo tratamento (não adianta corrigir o defeito sem melhorar a força do músculo). Infelizmente a reportagem não revela como o estudo está sendo realizado, em que animais, onde será divulgado cientificamente, etc. O pesquisador tem uma página no site da Universidade e até o momento não respondeu ao e-mail enviado para nos fornecer mais detalhes do experimento.

Austrália - no dia 11/04 publiquei  a seguinte notícia: Pesquisa  busca alterar a severidade da Distrofia Muscular de Duchenne; hoje recebi os esclarecimentos do Dr.Andrew Hoey por e-mail; ele esta utilizando oligonucleotídeos que foram injetados no músculo e possibilitaram que a célula consiga transcrever a distrofina, mesmo apresentando uma mutação; estes oligonucleotídeos foram sintetizados por Steve Wilton; ele esclarece que as pesquisas estão em fase inicial e o que justificou a notícia no site é que este tratamento possibilitou a melhora da força muscular que é o objetivo de qualquer tratamento. A pesquisa no momento envolve um modo de levar estes oligonucleotídeos para todas as células.

USA - no número de hoje da  Proceedings of the National Academy of Sciences, Paul Martin e colaboradores descreveram que o aumento de CT GalNac transferase pode bloquear a fraqueza muscular de camundongos portadores de distrofia muscular experimental. Esta é uma nova perspectiva para pesquisas em  terapia da distrofia muscular, nunca antes descrita. Os autores descrevem que esta enzima esta ligada a um pequeno açúcar e se concentra em torno do complexo de proteínas da utrofina. Os camundongos portadores de distrofia receberam uma quantidade extra de genes desta enzima que se espalharam na superficie das células musculares junto com a utrofina e impediu degeneração muscular. Em seres humanos esta enzima poderá ser liberada por terapia gênica ou ativada por drogas. Esta enzima teria vantagens sobre outras formas de terapia gênica (tamanho da molécula e menor efeitos colaterais). Leia o artigo na integra aqui.

Alemanha - neste estudo 2 cães com distrofia muscular que foram submetidos a retirada das células de um marca-passo natural do coração receberam células musculares cardíacas fetais, injetadas na parede do músculo cardíaco; o resultado mostrou que estas células fetais se diferenciaram nas células do marca-passo e passaram a exercer a sua função.

USA - neste trabalho os pesquisadores utilizaram camundongos com deficiência de sarcoglican que receberam correção genética das alterações dos músculos esqueléticos. Apesar do tratamento genético para os músculos periféricos as alterações do coração persistiram demonstrando a independência de ambas as alterações.

Dinamarca e USA -  para alguns pesquisadores a utilização da utrofina  é o melhor caminho para a cura da distrofia muscular. Ela não é uma substituição perfeita da distrofina mas pode ocupar o seu lugar mas pode causar uma melhora substancial (comprovada em camundongos). Conseguir aumentar a produção da utrofina é um caminho que está sendo estudado.  Neste importante artigo os pesquisadores dinamarqueses e americanos desvendaram etapas da transcrição da utrofina. Estes achados poderão auxiliar a definir alvos para a estimulação da produção da utrofina pelas células musculares. 

USA - Johnny Huard é um pesquisador da Universidade de Pittsburgh com muitos trabalhos publicados sobre as células tronco musculares. Nesta pesquisa, o seu grupo  em conjunto com Anton Wernig da Universidade de Bonn identificou uma terceira linhagem de células tronco musculares com potencial maior que as outras já descritas e comparável as células tronco obtidas de linhagem sanguínea. As células desta linhagem quando transplantadas em camundongos  aumentaram a capacidade de regeneração muscular e a expressão da distrofina por mais tempo. Estas células conseguiram se multiplicar in vivo e não desencadearam resposta imunológica estando os animais sem imunossupressão. Estas células tem a capacidade de gerar vasos e nervos além de músculos. O autor acredita que estas células tem um alto potencial para utilização em técnicas de terapia gênica. Leia os comentários do artigo e entrevista de Huard na Pittsburgh Tribune-Review . 

Strasbourg - Está sendo realizado de 25 a 28 de maio de 2002 o Congresso da Sociedade Européia de Genética Humana na cidade de Strasbourg . Os resumos do Congresso que se relacionam com as distrofias musculares você pode ler aqui . Há um resumo das pesquisas com transplantes de mioblastos na Rússia.

Inglaterra - os autores desta pesquisa construiram um vetor viral (AAV) com uma mini-distrofina (3,8Kb); os vetores virais foram introduzidos em um músculo esquelético de camundongos com distrofia muscular experimental. Estes músculos expressaram a distrofina em mais de 50% das miofibrilas por mais de 20 semanas e houve efetiva restauração do complexo de proteínas associado a distrofina. Adicionalmente houve uma significativa reduçào das alterações degenerativas do músculo.

(Micro-dystrophin cDNA ameliorates dystrophic phenotypes when introduced in to mdx mice as a transgene - a ser publicado no Biochemical and Biophysical Research Communications 293: (2002) 1265–1272)

Japão - O uso de vetores virais é uma boa arma para a terapia gênica da distrofia muscular mas o tamanho do gene da distrofia é um fator limitante. Neste estudo foram criados camundongos trangênicos com distrofia muscular e introduzidos  em cada grupo de animais uma forma diferente de micro-distrofina. Uma destas formas de micro-distrofina promoveu melhora das alterações patológicas na biópsia do músculo e  também aumentou a força muscular do diafragma ( que ficou equivalente a força de camundongos normais). Em nenhum dos três modelos estudados ocorreu aumento da óxido nitríco sintetase neuronal (nNOS) que está relacionada com as alterações patológicas da distrofia muscular.

USA - Começa hoje em Boston, USA, e irá até 9 de junho, o Encontro da Sociedade Americana de Terapia Gênica. As mais recentes novidades em terapia gênica serão relatadas neste encontro. Dos 1374 resumos apresentados, 20 se referem a distrofia muscular. Leia os resumos aqui.  

Japão - a administração de uma substância antioxidante, o quelato de carnosina e zinco (catena-(S)-[&mgr;-[N(alpha)-(3-aminopropinyl)histidinnato-(2-)N(1),N(2),O:N(tau)]-zinc] melhora a força muscular de camundongos com distrofia muscular experimental. O quelato, conhecido como Z-103, foi administrado na dose de 150mg/Kg de peso. A administração dos componentes do quelato, o zinco e a carnosina, em conjunto ou isolados, não promoveu nenhum efeito.

USA -  camundongos com deficiência de laminina alfa 2 são utilizados como modelo experimental de distrofia congênita severa; os pesquisadores criaram camundongos deficientes em complemento e laminina alfa 2. O complemento  é um conjunto de frações  proteicas ativadas em processos inflamatórios e seu depósito  tem sido observado em biópsias musculares de distrofia muscular. Os animais com esta dupla deficiência apresentaram aumento da força muscular e da sobrevida quando tratados com uma forma de corticóide, a prednisolona. Como a atividade do complemento pode ser manipulada farmacologicamente este trabalho pode ter implicações futuras na terapia farmacológica da distrofia muscular congênita.

(Glucocorticoid-mediated regulation of utrophin levels in human muscle fibers

Isabelle Courdier-Fruh, Lee Barman, Alexandre Briguet, Thomas Meier)

Suiça - Muitos trabalhos tem sido feitos para explicar o mecanismo de ação dos corticóides na distrofia muscular. Neste estudo (que será publicado em breve na Revista Neuromuscular Disorders) os autores encontraram, após 5 a 7 dias de metilprednisolona, aumento da utrofina nos miotubos das amostras de biópsia muscular. Os níveis de de mRNA utrofina, no entanto, permaneceram estáveis. Provavelmente os efeitos do corticóides na utrofina podem decorrer de mecanismo pós-transcrição.

(Pharmacological control of cellular calcium handling in dystrophic skeletal muscle

Urs T. Ruegg, Valérie Nicolas-Métral, Corinne Challet, Katy Bernard-Hélary, Olivier M. Dorchies,

 Stéphanie Wagner, Timo M. Buetler) 

Suiça - Aumento do influxo de cálcio e do cálcio intracelular tem sido observado em vários modelos experimentais e pacientes com Distrofia Muscular de Duchenne. A metilprednisolona e a creatina que são usados no tratamento da Distrofia de Duchenne diminuem o cálcio de miotubulos de camundongos com distrofia experimental. A elevação do cálcio é um evento desencadeado pelo stress  e que ocasionará vários eventos que levarão à lesão muscular. Os autores confirmam a participação do óxido nítrico no desencadeamento destes eventos. Este artigo será publicado em um dos próximos números da Revista Neuromuscular Disorders.

USA - nesta pesquisa americana camundongos com distrofia muscular experimental receberam, enquanto estavam ainda no útero materno, por via intraperitoneal, transplante de células da medula óssea ou hepáticas fetais. Após 12 a 14 meses do nascimento as células injetadas foram identificadas nos músculos esqueléticos, no diafragma e no músculo cardíaco em porcentagem de 0,2 a 9%. 

USA - Neste estudo os pesquisadores compararam os efeitos da injeção intramuscular de mioblastos x stem cells de origem muscular (identificadas por Johnny Hurard, do mesmo grupo). A avaliação foi realizada 9 semanas após o transplante de células. Não houve alteração da massa muscular nos dois grupos estudados. Não houve alteração da contração muscular. O número de  miofibras que expressam a distrofina é muito baixo, e limitado a curta distância do local da injeção.

Cingapura -  notícia de janeiro deste ano mostra resultados, provavelmente experimentais de pesquisadores da National University of Singapore em conjunto com a Universidade de Kobe, utilizando a engenharia genética com a finalidade de reduzir a severidade da Distrofia Muscular de Duchenne. Provavelmente utilizando a mesma técnica dos pesquisadores australianos (11/04/02) eles tentam vencer a mutação genética com sequência de oligonucleotídeos tentando transcrever parcialmente a distrofina que poderia reduzir a severidade da doença.

Itália  - nesta pesquisa os autores procuraram identificar uma fração da medula óssea com maior potencial de diferenciação para células musculares e participação na reparação muscular na distrofia muscular experimental; os autores observaram a capacidade de diferenciação das células mas a capacidade de restauração da distrofina foi pequena.

França - a distrobrevina é uma das proteínas que faz parte do complexo de proteínas da distrofina; pesquisadores estudaram um parasita, Caenorhabditis elegans, deficiente em distrofina que foi modificado para promover uma superexpressão da distrobrevina. Houve retardo do aparecimento dos defeitos de locomoção e da degeneração muscular; os autores concluiram que a ausência da distrofina pode parcialmente ser suprida pelo excesso de distrobrevina e que esta proteína é parcialmente funcionante na ausência de distrofina. Outros autores tem discutido o uso desta proteína na terapia gênica. Em breve na Revista Neuromuscular Disorders será publicado o seguinte artigo: "Dystrobrevin dynamics in muscle-cell signalling: a target for therapeutic intervention in Duchenne muscular dystrophy?"  de Derek J. Blake, da Inglaterra.

Laura Passerinia, Pia Bernasconia, Fulvio Baggia, Paolo Confalonierib, Francesca Cozzib, Ferdinando Corneliob, Renato Mantegazzaa) 

Itália - a fibrose  muscular em doentes com Duchenne é mediada por citocinas fibrogências, como o "transforming growth factor  beta 1". Neste estudo em cães labrador com distrofia muscular a fibrose muscular e as citocinas foram estudadas em diferentes etapas da doença. Os níveis mais altos deste fator coincidem com o período de aparecimento da fibrose muscular que é precoce no cão (60 dias). Os níveis deste fator são significantemente mais altos nos cães com distrofia do que nos cães sadios. A partir destes dados os autores sustentam a hipótese de que o "transforming growth factor  beta 1" tem papel importante na fibrose muscular tanto nos cães como no homem.  Este estudo será publicado num dos próximos números da Revista Neuromuscular Disorders. IMPORTANTE: existem pesquisas que tentam reduzir o efeito deste fator atráves do uso de medicamentos.

Itália - neste estudo realizado in vitro os pesquisadores conseguiram corrigir a deleção 48-50 e restaurar a produção de distrofina utilizando trechos de RNA com antisense. Esta é uma das alternativas em estudos para a correção genética da distrofia muscular.

Inglaterra -  nesta pesquisa os autores criaram um vetor viral hídrido (adeno-vírus com genes de retrovírus) e estudaram seu potencial para a transferência da microdistrofina com injeção intramuscular em um modelo experimental de distrofia muscular. Os resultados mostraram que com este vetor a expressão da distrofina foi maior e mais prolongada com redução das alterações patológicas.

USA - anualmente se realiza se junho em Pittsburgh uma conferência reunindo vários pesquisadores que apresentam aos pais de pacientes com distrofia um resumo das pesquisas em andamento; os resumos das principais palestras são: função cardíaca - faz um resumo das alterações cardíacas na distrofia muscular de Duchenne e Becker, o por que elas ocorrem e que tipo de terapia gênica  está sendo testada; desenvolvimento de uma estratégia usando células autologas na distrofia muscular de Duchenne - os pesquisadores estão desenvolvendo uma técnica para corrigir as células da medula óssea em laboratório e tentando utilizá-las para corrigir a doença muscular; adenovirus como vetor para terapia gênica - neste resumo estão colocadas algumas das dificuldades para levar o gene da distrofina até o músculo e as estratégias para conseguir suplantar estes entraves; superexpressão da utrofina no tratamento da distrofia muscular de Duchenne - neste resumo o autor analisa as possibilidade de utilização da utrofina em substituição a distrofina; deflazacort e óxido nítrico no tratamento da distrofia muscular experimental - Judy E. Anderson divulga suas pesquisas sobre o papel do óxido nítrico na distrofia muscular experimental, sobre o papel do deflazacort que aumentaria os níveis de óxido nítrico muscular e os trabalhos em andamento que estudam os efeitos do deflazacort administrado em conjunto com as drogas que aumentam o óxido nítrico; miostatina - esta molécula identificada  muito recentemente tem a capacidade de inibir o crescimento muscular; camundongos com distrofia muscular e sem o gene responsável pela síntese da miostatina tem maior massa e maior força muscular; a descoberta de drogas inibidoras da miostatina poderia contribuir para o tratamento da distrofia muscular.

Canadá - No  10o Congresso Internacional de Doenças Neuromusculares dois grupos independentes apresentaram trabalhos que mostram que duas substâncias administradas em camundongos com distrofia muscular conseguiram retardar a evolução da doença através do aumento da utrofina. Um dos trabalhos realizado na França mostrou que a L-arginina pode aumentar os níveis de utrofina em camundongos com distrofia muscular. Outro grupo da Filadélfia encontrou que a proteína heregulina tem o mesmo efeito. Ambas retardaram a fraqueza muscular associada a doença. Desde 1989 os cientistas consideram a utrofina como um alvo para o tratamento da distrofia muscular, ou através da terapia  gênica ou aumentando a sua produção pela utilização de medicamentos. A L-arginina foi escolhida por ser um combustível da óxido nítrico sintetase, uma proteína que gera o óxido nítrico. A óxido nítrico sintetase é ligada a utrofina e se acredita que seu aumento pode ter o mesmo efeito que o aumento da utrofina. Após alguns meses de administração de L-arginina, que foi dada uma vez ao dia por 5 dias na semana, os músculos dos membros e da respiração mostraram poucos sinais de degeneração e a força dos músculos respiratórios era significantemente maior que nos camundongos não tratados. Os animais tratados com L-arginina apresentaram também níveis baixos de CK, a enzima liberada no sangue pelos músculos lesados. O grupo americano que estuda a utrofina há anos já tinha identificado que a heregulina, uma proteína liberada pelos nervos para estimular o desenvolvimento muscular,  tinha a capacidade de "ligar" o gene da utrofina. Os músculos dos membros receberam injeção de heregulina 2 vezes por semana por três meses e mostraram menos degeneração e aumento da resistência ao dano provocado pela contração muscular. Os resultados são ainda experimentais e não se sabe ainda a toxicidade da heregulina. Kay Davies que descobriu a utrofina sugere pelos seus estudos que os tratamentos devem aumentar os níveis de utrofina em cerca de 10 vezes para proteger completamente os músculos. Com a L-arginina os níveis de utrofina aumentaram em cerca de 2,5 vezes e com a heregulina 3 vezes.

Canadá -  realizou-se de 7 a 12 de julho de 2002, em Vancouver,  o 10o Congresso Internacional de Doenças Neuromusculares; o programa das aulas apresentadas no curso pode ser acessado aqui; os títulos dos trabalhos apresentados em poster estão aqui. Nos resumos dos trabalhos apresentados na Conferência da  Duchenne Parent Project (8/7/2002)  já se citava o papel da miostatina em reduzir o crescimento muscular e a possibilidade de sua inibição ser usada como tratamento da distrofia muscular. Hoje foram divulgados dois trabalhos independentes sobre o papel da miostatina na distrofia muscular experimental;  o primeiro trabalho, realizado pela equipe da Johns Hopkins, utilizou camundongos com distrofia muscular e sem o gene da miostatina. Estes camundongos tinham músculos mais fortes e menor evidência de fibrose (alteração lesiva do músculo). Em outro estudo um grupo da Filadélfia injetaram nos camundongos anticorpos que bloqueiam a miostatina (estes anticorpos foram produzidos em laboratório por uma empresa de biotecnologia, a Wyeth). Quando os camundongos jovens receberam duas vezes por semana a injeção de anticorpos por via abdominal os músculos respiratórios apresentaram redução dos sinais de degeneração. Os animais que receberam os anticorpos apresentavam músculos mais fortes e largos e redução dos níveis de CK (uma proteína liberada para o sangue pelos músculos lesados). Por razões não explicadas até o momento no primeiro estudo (camundongos sem o gene da miostatina) não houve redução da CK. O segundo estudo é importante por não envolver a terapia gênica que ainda está em fase experimental. O uso de anticorpos anti-miostatina será testado em cães com distrofia muscular. Estes anticorpos também serão testados em outras doenças musculares, em diabetes, AIDS, etc.

USA -  as infecções por enterovírus no coração e a ausência de distrofina podem causar cardiomiopatia. A interação destes dois fatores  é desconhecido. Os autores já haviam descrito que a protease do enterovírus pode quebrar a distrofina. Os autores decidiram testar se a falta de distrofina predispõe a cardiomiopatia pelo enterovirus. Os pesquisadores observaram que a infecção por enterovirus causava cardiomiopatia mais severa, com piora ao longo do tempo, nos camundongos com distrofina dos que não apresentavam esta deficiência. Provavelmente a ausência da distrofina pode favorecer a entrada dos vírus nos músculos cardíacos. Os autores concluem que a infecção viral pode influenciar a severidade e a penetrância da cardiomiopatia que ocorre em camundongos com distrofia muscular.

Cingapura - os métodos até o momento para cultivo de células tronco utilizam células de animais, em geral camundongos ou outras espécies; há um temor da possibilidade de transmissão de doenças ou outras formas de reação imunológica; os pesquisadores patentearam um método de cultivo livre do contato com produtos derivados de animais. Esta notícia foi comentada em vários sites de notícias:

http://www.lasvegassun.com/sunbin/stories/archives/2002/aug/06/080606028.html

http://sg.news.yahoo.com/reuters/asia-119317.html

O resumo da pesquisa está aqui:

Human feeders support prolonged undifferentiated growth of human inner cell masses and embryonic stem cells

Mark Richards1, Chui-Yee Fong1, Woon-Khiong Chan2, Peng-Cheang Wong1 & Ariff Bongso1
Correspondence should be addressed to A Bongso. e-mail: [email protected]

Previous reports have demonstrated the growth of undifferentiated human embryonic stem (HES) cells on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeders and on laminin- or Matrigel-coated plastic surfaces supplemented with MEF-conditioned medium1-3. These xenosupport systems run the risk of cross-transfer of animal pathogens from the animal feeder, matrix, or conditioned medium to the HES cells, thus compromising later clinical application. Here we show that human fetal and adult fibroblast feeders support prolonged undifferentiated HES cell growth of existing cell lines and are superior to cell-free matrices (collagen I, human extracellular matrix, Matrigel, and laminin) supplemented with human or MEF feeder–conditioned medium. Additionally, we report the derivation and establishment of a new HES cell line in completely animal-free conditions. Like HES cells cultured on MEF feeders, the HES cells grown on human feeders had normal karyotypes, tested positive for alkaline phosphatase activity, expressed Oct-4 and cell surface markers including SSEA-3, SSEA-4, Tra 1-60, and GCTM-2, formed teratomas in severely combined immunodeficient (SCID) mice, and retained all key morphological characteristics. Human feeder–supported HES cells should provide a safer alternative to existing HES cell lines in therapeutic applications.

USA e Itália - a distrofia fáscio-escápulo-umeral é a terceira forma de distrofia mais frequente nos Estados Unidos. Cientistas da Universidade de Massachusetts (USA) e da Universita' degli Studi di Pavia (Itália) identificaram a alteração genética desta forma de distrofia. Já se sabia previamente que o defeito genético estava localizado em uma parte do cromossomo 4, com perda de uma sequência de nucleotídeos. Neste estudo os pesquisadores encontraram que a  mutação presente na doença ocasiona alteração de uma proteína complexa que suprime a atividade dos genes vizinhos e pode ser responsável por algumas alterações da doença. A descoberta é comentada em vários sites de notícia:

http://news.bbc.co.uk/1/hi/health/2181475.stm

http://www.health-news.co.uk/showstory.asp?id=94462

http://www3.cosmiverse.com/news/science/0802/science08090205.html

http://story.news.yahoo.com/news?tmpl=story&u=/nm/20020808/hl_nm/genes_md_dc_1

USA - nesta revisão que está disponível integralmente e em inglês os autores descrevem as principais formas de stem cells e os seus usos prováveis ou que já estão sendo testados.

USA - a ViaCell é uma empresa voltada para a pesquisa em doenças neurológicas, câncer, distrofia muscular, etc. Ela tem uma subsidiária a ViaCord que faz pesquisas com células tronco inclusive tendo desenvolvido um método para facilitar a obtenção destas células em um meio com outras células. No dia 14 de agosto a empresa divulgou um relatório informando que obteve uma patente mundial para a proteína dímero Fator de Crescimento dos Fibroblastos (dFGF) que poderá ser útil no tratamento do derrame cerebral e de outras doenças neurológicas e neuromusculares. Esta proteína foi desenvolvida por cientistas do Massachusetts Institute of Technology (M.I.T.). Fatores de crescimento dos fibroblastos (FGF) pertencem a uma família de proteínas que promovem proliferação e sobrevida de inúmeros tecidos como o cérebro, sistema vascular e músculos. Nos primeiros estudos em derrame cerebral observaram uma melhora dos animais com  administrando a droga no dia seguinte ao derrame cerebral. Espera-se que logo se iniciem estudos em camundongos com distrofia muscular. A transcrição da notícia você encontra abaixo.

"ViaCell Obtains Exclusive Worldwide License to Novel Protein for Use in Treatment of Stroke Recovery and Other Neurological and Neuromuscular Disorders
Dimerized Fibroblast Growth Factor (dFGF) Shows Potential to Enhance Neurological Recovery After Stroke

BOSTON, Aug. 14 /ViaCell Inc., a premier cellular therapy company, announced that it has obtained an exclusive worldwide license for dimerized fibroblast growth factor (dFGF), a novel protein developed by
scientists at Massachusetts Institute of Technology (M.I.T.), with applications for the treatment of stroke and other neurological disorders.
ViaCell Neuroscience, a subsidiary of ViaCell, will initially develop dFGF as a product to enhance functional recovery in patients who have suffered a stroke.Marc Beer, ViaCell's chairman and chief executive officer, stated, "Our team at ViaCell Neuroscience is committed to the development of new stem cell
and stem cell stimulating therapies to treat neurological diseases.  We are very encouraged by the development of dFGF, which represents a major advance in our potential to treat stroke and numerous other neurological disorders."
 ViaCell Neuroscience's exclusive license includes rights to intellectualn property covering dFGF and its use in treatment of all neurological disorders, including stroke.  These patents are based on inventions of Ram Sasisekharan, Ph.D., professor in the department of bioengineering and environmental health
at M.I.T.
"We believe that this growth factor may prove to be a very important contributor in ongoing research to develop effective therapies to treat neurological diseases," said Dr. Sasisekharan.
Fibroblast growth factors (FGFs) are a family of proteins in the human body responsible for the proliferation and survival of cell types that comprise the bulk of living cells in many tissues, including brain, vascular
system, and muscle.  Dimerized fibroblast growth factor (dFGF) is a novel combination of two subunits of FGF protein that have been linked together.
Over the past 15 months, a team of researchers at ViaCell Neuroscience has found that the intravenous administration of dFGF markedly enhances neurological recovery in an animal model of stroke, even when given a day or more after the event has occurred.  The effect is most likely due to stimulation of endogenous stem cells within the brain.
"The results to date are very encouraging," said Seth Finklestein, M.D., head of ViaCell Neuroscience and vice president of ViaCell, Inc.  "We believe dFGF is an important protein that has the potential to be a breakthrough
therapy for stroke and other neurological disorders."
Development of dFGF therapies will be conducted at the ViaCell research and development facility in Worcester, MA, under the direction of Dr.Finklestein.  Prior to joining ViaCell, Dr. Finklestein served as an associate professor of neurology at Harvard Medical School and was also associate neurologist at Massachusetts General Hospital for more than 12 years.  He continues his clinical activities at Massachusetts General Hospital.
While the effects of stroke can be devastating, there are no treatments available today to enhance patient recovery.  The only approved therapy for treating stroke is tissue plasminogen activator (tPA) which has been shown to be useful in minimizing the initial damage from stroke.  However, treatment
must be administered within three hours of stroke onset.
"With dFGF, we have the potential to provide an entirely new therapy for stroke patients, namely the administration of a treatment days or even weeks after a stroke has occurred, in order to improve neurological function and quality of life," said Dr. Finklestein.
Stroke or "brain attack" is a clot (ischemia) or hemorrhage in the brain that frequently results in damage to brain tissue.  Stroke is the third leading cause of death in the United States, killing nearly 160,000 Americans
each year.  An additional 590,000 Americans experience and survive a new or recurrent stroke each year; two-thirds of these patients live with moderate to severe paralysis, or speech, vision, or memory loss.  There are four million stroke survivors in the U.S.  The National Stroke Association estimates that stroke costs the United States $30 billion annually.
About ViaCell, Inc.
 ViaCell, Inc. (http://www.viacellinc.com) is a clinical-stage biotechnology company with a cellular medicine pipeline that focuses in the areas of cancer, neurological diseases, diabetes and muscular dystrophy.
ViaCell offers umbilical cord blood stem cell preservation services through Viacord (http://www.viacord.com), a subsidiary of ViaCell.  ViaCell is developing amplified, high-definition stem cell products based on its patented technology, Selective Amplification(TM), for the expansion of targeted populations of stem cells.  ViaCell is currently conducting a Phase I clinical trial with its lead product, produced through Selective Amplification(TM). ViaCell Neuroscience, a subsidiary of ViaCell, is committed to the development
of new molecular and cellular treatments to prolong life and restore function in neurological diseases, including stroke, head trauma, amyotrophic lateral sclerosis (ALS), genetic enzyme deficiencies and muscular dystrophy, among others."

USA - X. Xiao é um pesquisador de Pittsburgh que desenvolveu um  minigene da distrofina, com tamanho suficiente pequeno para ser colocado em um vetor viral e ser utilizado em terapia génica. Em outras pesquisas ele já tinha demonstrado que este minigene era eficiente. Nesta pesquisa ele injetou o vírus em um músculo de camundongos adultos com distrofia muscular experimental. Os resultados demonstraram que houve um aumento significativo da função muscular nos camundongos que receberam este tratamento. As pesquisas deste grupo são muito promissoras mas seguem em um ritmo extremamente lento. 

USA - O pequeno protoglican rico em leucina é uma substância ligada a parte externa da membrana celular. Nesta pesquisa os pesquisadores criaram camundongos deficientes nesta substância e observaram que estes camundongos apresentam características encontradas em várias doenças como a distrofia muscular, a osteoporose, a osteoartrose, a síndrome de Ehlers Danlos e doenças da córnea. O papel desta substância na distrofia muscular ainda precisa ser esclarecido.

Austrália - fenoterol e clenbuterol são drogas beta-adrenérgicas utilizadas no tratamento da asma brônquica. O clenbuterol tem sido testado em várias formas de distrofia com alguns resultados positivos. Neste experimento em ratos os pesquisadores australianos compararam os efeitos do clenbuterol em comparação ao fenoterol  na força muscular de ratos sem doença neuromuscular. Os resultados demonstraram que o efeito do fenoterol é maior que o do clenbuterol. Por estes resultado novos estudos deverão ser feitos para observar se na doença neuromuscular o efeito do fenoterol também é maior.

USA - A interleucina 15 é um fator presente no nosso organismo que administrado a ratos com câncer causou aumento da massa muscular. Os efeitos observados com o excesso de interleucina 15 foram semelhantes aos observados com o IGF1, outro fator do nosso organismo que está sendo estudado na distrofia muscular e para aumentar a força muscular de atletas. Os efeitos da interleucina 15 ocorrem com ou sem IGF1 e são mais completos: além de aumentar a síntese de proteínas, como o IGF1 impede a  destruição das proteínas. Não há estudos da interleucina 15 na distrofia muscular.

USA - Uma das preocupações com a terapia gênica é a maneira como o organismo irá reagir ao vírus que levará o gene até a célula e a reação à proteina que irá ser produzida pelo gene.Esta resposta pode prejudicar o resultado do tratamento. Neste trabalho os pesquisadores estudaram a resposta imunológica em camundongos portadores de distrofia muscular que receberam um adenovirus que continha o gene da distrofina e da beta galactosidase. A injeção do vírus diretamente no músculo resultou na expressão estável da distrofina por 5 meses em camundongos recém-nascidos e por 4 semanas em camundongos adultos. Os autores encontraram anticorpos contra o vírus nos camundongos adultos mas não nos recém-nascidos. No entanto anticorpos contra a distrofina tanto em camundongos recém-nascidos como nos adultos. Este resultado indica que quando for possível a terapia gênica haverá necessidade de um tratamento complementar (drogas imunossupresoras semelhante as que os transplantados recebem) para impedir que após o tratamento ocorra reação imunológica que prejudicaria o resultado do tratamento.

USA - em artigo a ser publicado online esta semana (ainda não disponível hoje) na revista "Proceedings of the National Academy of Sciences" o pesquisador Jeffrey S. Chamberlain, professor de Neurologia da Escola Medica da  Universidade de Washington, obteve ótimos resultados em camundongos com distrofia muscular tratados com injeção intramuscular de um vetor viral com o gene integral da distrofina. Os camundongos tratados apresentaram aumento da força muscular em 40% superior aos que não foram tratados. Outra boa notícia é que os resultados foram equivalentes em camundongos jovens e adultos, indicando que este tratamento será possível também em quem já apresenta  os sintomas da doença. Alguns nós ainda precisam ser desatados: a) qual será a resposta do sistema imunológico a injeção deste vírus?; b) qual será o resultado quando a injeção do vírus for realizada por via endovenosa?

Esta notícia ganhou um grande destaque no mundo hoje:

http://www.msnbc.com/news/808862.asp?0si=-#BODY

http://news.bbc.co.uk/2/hi/health/2262217.stm

http://www.cbsnews.com/stories/2002/08/15/tech/main518846.shtml

http://www.health-news.co.uk/showstory.asp?id=97108

http://www.tribnet.com/news/local/story/1793435p-1909016c.html

http://www.modbee.com/24hour/healthscience/story/538581p-4259208c.html

http://www.gainesvillesun.com/apps/pbcs.dll/article?Site=GS&Date=20020917&Category=NEWS02&ArtNo=209170328&Ref=AR&Profile=1001

http://www.wcax.com/Global/story.asp?S=937526&nav=4QcS4R25BHZI

http://www.zwire.com/site/news.cfm?newsid=5391292&BRD=1281&PAG=461&dept_id=7574&rfi=6

França - Transgene, uma empresa francesa de biotecnologia, e que está realizando pesquisas avançadas com terapia gênica obteve ontem nos Estados Unidos 10 novas patentes para suas pesquisas avançadas com vetores virais e não virais para tratamento de diversas doenças. No comunicado a imprensa a empresa se autodenomina como a primeira que possui um vetor não viral com o gene da distrofina para tratamento da distrofia muscular de Duchenne. No site da Trangene há informações de que "diversas" pesquisas estão em andamento para avaliar as possibilidades de tratamento com vetores virais e não virais da distrofia muscular. Em se confiando nestas informações a empresa é a que está investindo mais e em diferentes linhas de pesquisa no tratamento das distrofias musculares.

USA - a utilização de vírus para levar os genes até as células é a técnica mais pesquisada mas ainda não se conseguiu sucesso total; alguns nós destas pesquisas estão nos artigos anteriores deste mês;cientistas da Universidade de Stanford desenvolveram uma nova técnica de terapia gênica que permite levar mais facilmente os genes até as células, sem usar vetores virais; por esta técnica o gene seria levado por bacteriófagos e se incorporaria nestas células enquanto elas estivessem vivas. Eles testaram esta técnica em laboratório utilizando a pele de quatro pacientes com epidermólise bolhosa distrófica (doença de pele). Os resultados foram positivos em todas as amostras demonstrando a possibilidade de utilização desta técnica para levar genes grandes como o da distrofia muscular e o da fibrose cística.

O resumo integral do artigo saiu na revista Nature Medicine (Stable nonviral genetic correction of inherited human skin disease Susana Ortiz-Urda, Bhaskar Thyagarajan, Douglas R. Keene, Qun Lin, Min Fang, Michele P. Calos & Paul A. Khavari - Published online: 16 September 2002, doi:10.1038/nm766)
 

USA - A repercussão da divulgação do artigo acima trouxe aos pais uma grande expectativa pela possibilidade de tratamento da distrofia muscular através da utilização de células tronco da medula óssea; o artigo também criou uma pressão adicional á Associação Americana da Distrofia Muscular (MDA-USA) por causa da demora em se iniciar as pesquisas clínicas. Para esclarecer os pais a MDA divulgou uma nota (transcrita integralmente abaixo) esclarecendo que o uso de células tronco da medula até o momento mostrou baixos resultados e que os pesquisadores identificaram várias dificuldades que impedem no momento a realização de estudos clínicos em seres humanos; a nota afirma também  que esforços estão sendo feitos para apressar estes estudos sobre a utilização de células tronco.

"September 13, 2002

TO: Families of Those Affected by Duchenne and Becker Muscular Dystrophy

FROM:     Robert Ross
                President & CEO
                Muscular Dystrophy Association

RE: Application of Stem Cell Therapy in Treating Neuromuscular Diseases

Stem cell research is an emerging area of scientific investigation which holds extraordinary promise for advancing the development of therapies for the muscular dystrophies and other neuromuscular disorders. Media coverage of reports on the use of stem cells has been extensive . A September 10, 2002 article in The New York Times (copy attached) summarizes one such report. The following is offered to help place this and similar reports in a realistic context.

The Times article indicates that MDA Scientific Advisory Committee Member Louis M. Kunkel, Ph.D. and his team have verified the presence of donor cells in the skeletal muscle of a young man with Duchenne muscular dystrophy who had earlier received a bone marrow transplant (a source of stem cells) for an immune deficiency disease. Although it's significant that some donor cells were found in his muscle tissue, the efficiency of the procedure was very low.

While researchers are optimistic that stem cell therapy will be used to effectively treat neuromuscular disorders, the low efficiency of stem cell incorporation into muscle at this point means that the therapeutic application of stem cell technology is still a number of years in the future.

The Association has taken steps to accelerate stem cell research by sponsoring meetings of specialists to review and evaluate progress, and has established a stem cell working group to guide the Association's efforts in this area. At its most recent meeting the group focused on identifying a series of critical milestones that must be met in order to conduct a bone marrow transplant-based clinical trial. At present, the risk/benefit ratio of such a clinical trial in youngsters with neuromuscular disease does not support it.

Information about the status of specific neuromuscular disease clinical trials is available on the Association's Web site at www.mdausa.org by clicking on "Research" and "Active Clinical Trials"."

USA - sarcoglicanopatias são formas recessivas de distrofia muscular tipo cinturas; neste estudo os cientistas criaram dois vetores vitais contendo os genes da alfa ou beta sarcoglicans. Os vetores foram injetados em camundongos que apresentavam deficiência destes sarcoglicans. Os camundongos com deficiência em beta sarcoglican tratados com o vírus correspondente apresentaram a expressão do gene por 21meses após o tratamento. No entanto os camundongos deficientes em alfa sarcoglicans e tratados com o vetor viral apresentaram resultados  nos primeiros dias mas após 21 a 28 dias apresentaram redução da expressão do gene e sinais de inflamação nos músculos; para tentar entender o que ocorreu os pesquisadores criaram camundongos deficientes em alfa sarcoglican e com deficiência imunológica e observaram que o mesmo fato ocorreu demonstrando a superexpressão do gene foi responsável pela toxicidade para as células. Novas pesquisas deverão esclarecer se será possível evitar este efeito tóxico desta terapia gênica e prolongar os efeitos positivos.

USA -  Gentamicina é um antibiótico usado há mais de 30 anos.  Há 3 anos surgiu a  notícia que poderia ser usada nas Distrofias Musculares. Ele seria útil na mutacão de ponto que esta presente na minoria dos pacientes. Ele ajudaria a transpor o ponto desta mutação permitindo a síntese de distrofina no caso da Distrofia Muscular de Duchenne. Os resultados dos primeiros estudos não demonstraram efeito. Por esta reportagem podemos ver que os estudos prosseguem em várias doenças genéticas como a hemofilia, as distrofias musculares ea fibrose cística. O entrevistado na reportagem acha que os primeiros estudos não conseguiram "enxergar" os efeitos na produção da distrofina. A notícia repercutiu em outros jornais online:

http://www.tampatrib.com/MGAQ73OSF6D.html

http://www.gadsdentimes.com/news/stories/7254newsstorypage.html

USA - contrariando a decisão do Presidente Bush, o governo da California irá liberar e estimular as pesquisas com células tronco de origem embrionária com finalidade terapêutica. Esta decisão que vale a partir de 2003 dará grande impulso as pesquisas. A clonagem reprodutiva continuará proibida.

USA - a doença de Ullrich é uma forma rara de distrofia muscular (foi descrita em 1930). Os achados da doença são fraqueza muscular com contraturas das articulações proximais e hiperextensão das articulações distais com aparecimento ao nascimento ou na primeira infância. Recentemente se descreveu a deficiência do colágeno VI nestes pacientes. Neste trabalho o autor relata um caso desta forma de distrofia com deficiência total do colágeno VI. Estudando a biópsia com a microscopia eletrônica ele pode identificar alteração das microfibrilas do músculo e sugeriu uma provável explicação para a fraqueza muscular (perda da conexão entre o interstício e a membrana basal).

França e USA - as empresas Trangene e Mirus anunciaram hoje  a realização de uma pesquisa inédita: o uso de plasmídeos como vetor injetado por via intra-arterial utilizando a tecnologia da Mirus.  Esta tecnologia permitirá a eficiente entrega do gene ao músculo em pelo menos 10% dos grandes músculos do quadril em modelos animais. A tecnologia da Mirus consiste em um eficiente método de transferir com alta e controlada pressão os vetores do sangue ao músculo. Este método poderá abrir uma nova perspectiva para uma terapia gênica eficiente. A Transgene é a empresa que está realizando o primeiro estudo em humanos com terapia gênica na distrofia muscular de Duchenne e Becker.

USA - alterações do equilíbrio do cálcio tem sido implicadas com as alterações musculares da distrofia muscular. Alguns trabalhos já tinham relacionado a calpaina dependente do cálcio com as alterações da distrofia muscular. Como a ativação da calpaína lesa o músculo ainda não tinha sido determinada. Para estudar a ação da calpaína na destruição muscular os pesquisadores criaram um camundongo com distrofia muscular que produzia um excesso de calpastatina. Calpastatina é um inibidor específico  da calpaína m e µ mas não inibe a calpaína 3 (p94). Dois grupos de camundongos foi criado de acordo com a quantida de calpastatina que produziam. Os dois grupos demonstraram redução da necrose. As lesões observadas foram poucas e pequenas. Os que tinham menos lesões produziam mais calpastatina. As alterações observadas demonstram que a calpaína tem um papel importante no processo de necrose do músculo na distrofia muscular e a inibição desta proteína (por terapia gênica ou medicamentos) pode ser uma opção de tratamento válida na distrofia muscular.  

Canadá -  com o intuito de melhorar o desempenho da terapia gênica, os pesquisadores desenvolveram um vetor viral contendo dois genes da distrofina e um promotor. Os resultados demonstraram uma grande expressão da dostrofina com a injeção do vírus por via intramuscular em camundongos adultos e neonatos. Nos camundongos neonatos a expressão foi 5 vezes superior ao músculo normal. Este grande aumento foi transitório e se seguiu ao aparecimento de uma reação imunológica. A aplicação da terapia em camundongos sem defesa imunológica demonstrou que a expressão do gene se mantinha por mais tempo. Este trabalho demonstra a viabilidade da terapia gênica e demonstra que durante este tratamento será necessária a utilização de drogas imunossupressoras.

USA -  a mutação de ponto é uma causa infrequente de doenças genéticas como a distrofia muscular. Existem muitos estudos para a pesquisa de drogas que possam corrigir este defeito com drogas, como a gentamicina (notícia de 23/09/2002). Foi revelado em uma palestra esta semana na Sociedade Americana de Genética Humana que a empresa PTC Therapeutics tem uma quantidade de pequenas moléculas (com peso molecular menor que 500) que poderiam ser úteis nesta situação e que estariam sendo testadas em animais e pequenos vermes.

USA - Os pesquisadores da Universidade de Iowa estavam estudando um modelo em camundongo para desenvolvimento de distrofia muscular com a retirada de uma proteína, a distroglican. Inicialmente eles observaram que os animais apresentavam uma forma de distrofia muscular mas estranhamente estes camundongos mantinham a capacidade de regeneração muito alta. Alías eles apresentavam hipertrofia muscular (aumento do músculo maior que os animais do grupo controle). Os pesquisadores identificaram que um grupo específico de células musculares, denominadas células satélites eram produtoras de distroglicans e eram eficientes em restaurar o dano muscular da distrofia muscular. A pesquisa demonstrou que a manutenção da capacidade regenerativa das células satélites pode prevenir o desenvolvimento da forma severa da distrofia muscular. O mal funcionamento destas células pode influenciar na severidade da doença e pode ser um alvo de estratégias de tratamento. Uma outra descoberta da pesquisa é que as células satélites não perdem a capacidade de regeneração com a idade (não ficando exauridas com a idade). As células satélites funcionariam como as células tronco. Os animais que sofreram irradiação para destruir as células satélites apresentaram forma severa da distrofia muscular. Foram criados camundongos que não produziam distroglican nas células musculares e nas células satélites e eles também apresentaram forma severa da doença.

USA - cientistas da Universidade de Washington realizaram uma pesquisa para determinar o melhor uso das stem cells originadas do cordão umbilical. A exposição das células do cordão a uma proteína denominada Delta-1 provocou um significativo aumento das células tronco por mecanismo ainda desconhecido. O artigo foi publicado na edição de 22 de outubro da revista Journal of Clinical Investigation.

USA - neste Congresso realizado em Baltimore de 15 a 19 de outubro de 2002 foram apresentados vários trabalhos relacionados a distrofia muscular. Os mais importantes relacionados com o tratamento da doença estão aqui. Em um deles é descrito o uso de bifosfonato no tratamento da osteoporose de portadores de distrofia muscular e outras doenças genéticas; nos outros três são descritas formas de terapia gênica em modelos experimentais de distrofia muscular.

(Esta notícia foi divulgada no site no dia 25/06/2002 e agora esta sendo repetida pois só nesta semana o artigo foi publicado)

Itália - a fibrose  muscular em doentes com Duchenne é mediada por citocinas fibrogências, como o "transforming growth factor  beta 1". Neste estudo em cães labrador com distrofia muscular a fibrose muscular e as citocinas foram estudadas em diferentes etapas da doença. Os níveis mais altos deste fator coincidem com o período de aparecimento da fibrose muscular que é precoce no cão (60 dias). Os níveis deste fator são significantemente mais altos nos cães com distrofia do que nos cães sadios. A partir destes dados os autores sustentam a hipótese de que o "transforming growth factor  beta 1" tem papel importante na fibrose muscular tanto nos cães como no homem.   IMPORTANTE: existem pesquisas que tentam reduzir o efeito deste fator atráves do uso de medicamentos.

Canadá - uma das dificuldades enfrentadas para um bom resultado da terapia gênica é fazer com  que a maioria das células passem a expressar o gene que foi administrado. Estudos prévios tinham demonstrado que o uso de ultrassom contribuia para aumentar a permeabilidade à macromoéculas como o plasmídeo DNA, um vetor usado na terapia gênica. Na presente pesquisa os autores conseguiram aumentar a eficiência da terapia gênica em camundongos portadores de distrofia muscular utilizando o ultrassom; não ocorreu lesão muscular com o uso do ultrassom.

USA -  a causa primária da Distrofia Muscular de Duchenne é a mutação do gene da distrofina. A ausência desta proteína rompe a estrutura proteína da membrana muscular. Há ainda controvérsia entre os pesquisadores para entender como as alterações do músculo ocorrem. Para melhorar este entendimento este grupo liderado por Kunkel, identificador do gene da distrofina, estudou biópsias musculares de 12 pacientes com Duchenne e 12 controles para identificar todos os genes que pudessem estar alterados na doença. A análise de 105 genes diferentes encontrou que havia superexpressão de vários genes, que poderiam estar tentando compensar a ausência da distrofina, ou seja, tentado regenerar naturalmente as células musculares. Entendendo melhor como as alterações do músculo ocorrem será mais fácil identificar o melhor caminho para tratá-la.

USA - O grupo de Johnny Huard tem uma linha de pesquisa bastante avançada para estudar as células tronco no tratamento da distrofia muscular. Nesta pesquisa, através da identificação de um marcador nas células tronco (CD34) ele conseguiu separar as células com maior capacidade de produzir regeneração dos músculos. Esta informação será útil para escolher as células mais apropriadas para o tratamento da distrofia muscular.

USA - a óxido nítrico sintetase (nNOS), enzima que interage com as proteínas da membrana celular, esta significantemente reduzida nos pacientes com  Distrofia Muscular de Duchenne e na distrofia muscular experimental. Há fortes indícios que a deficiência da nNOS pode contribuir paras as alterações dos músculos nesta doença. Neste trabalho os pesquisadores procuraram identificar se há redução da nNOS em outras formas de distrofia. Os resultados mostraram que a nNOS está redudiza nos músculos com ausência de sarcoglicans (distrofia tipo cinturas). Os dados sugerem que a redução da nNOS pode contribuir para as alterações musculares da distrofia tipo cinturas.

Japão - a doença de Ullrich é uma forma de distrofia muscular congênita clinicamente caracterizada por fraqueza muscular, múltiplas contraturas nas articulações proximais e hiperextensão das articulações distais. Recentes estudos tem demonstrado a deficiência do colágeno VI nestes pacientes. A fibronectina é um componente da matrix extracelular. O comportamento da fibronectina nas células é mediado por receptores de fibronectina.  Neste estudo os pesquisadores estudaram células dos portadores de doença de Ullrich e observaram redução dos receptores de fibronectina nos fibroblastos e nas células de pele destes pacientes. Este resultado sugere que a redução dos receptores da fibronectina pode estar relacionada a deficiência do colágeno VI e as anormalidades na adesão celular pode estar relacionadas com as alterações observadas nesta doença.

Dinamarca - a distrofia muscular é caracterizada por degeneração muscular e insuficiente regeneração e reposição das fibras musculares. Muitos pesquisadores estão procurando novas formas de produzir regeneração dos músculos. Neste trabalho os pesquisadores  estudaram o efeito da ADAM12, uma metaloprotease da membrana celular, normalmente associada a regeneração do músculo esquelético. Os pesquisadores demonstraram que a superexpressão da ADAM12 em camundongos com distrofia muscular reduz as alterações musculares; nestes camundongos ocorreu redução da necrose e inflamação, níveis baixos da enzima CK e menor coloração da fibra muscular pelo azul de Evans. O trabalho demonstra que o ADAM12 contribui, direta ou indiretamente, para a regeneração muscular, estabilidade e sobrevida.

Japão -  neste artigo que estuda várias formas de vírus no tratamento da distrofia muscular experimental em camundongos demonstrou-se que há uma resposta inflamatória nos músculos que receberam o tratamento com o vírus. Neste trabalho os pesquisadores tentam entender os motivos desta reação para tentar impedí-la ou minimizá-la

USA -  Os órgãos para transplante são escassos e podem causar rejeição; as células tronco são escassas e ainda há polêmicas para a sua utilização; os pesquisadores do Hospital Pediátrico da Filadélfia utilizando células tronco administradas no pré-natal e manipulação das células após o nascimento provocaram imunotolerância em camundongos permitindo que  eles doem células para muitas pessoas sem efeitos tóxicos. Este artigo foi publicado no número de agosto e setembro na revista Blood. Este achado pode aumentar as possibilidades de transplantes de órgãos e o uso em doenças genéticas como a leucemia, anemia falciforme, distrofia muscular e doenças hepáticas e renais. 

USA -  O nosso organismo reage a qualquer substância ou agente estranho com a produção de anticorpos ou outros agentes de defesa. A utilização de vírus para levar o gene da distrofina aos músculos em vários modelos experimentais tem ocasionado reações imunológicas nos músculos o que acarreta a necessidade de utilização de drogas imunossupressoras como nos transplantes de órgãos. Este artigo recente aborda vários exemplos de terapia gênica em animais com distrofia muscular experimental e tenta estudar quais os mecanismos desta reação imunológica. Entender por que estas alterações ocorrem permitirá tentar evitá-la ou minimizá-la.

Austrália  -  o clenbuterol tem sido estudo em várias formas de distrofia como droga estimuladora da contração muscular. Neste estudo comparativo em ratos usado fenoterol x clenbuterol (as duas drogas tem o mesmo mecanismo de ação) os pesquisadores mostraram que o fenoterol tem maior efeito na contração muscular do que o clenbuterol.

Inglaterra - a utrofina é uma proteína celular que poderia substituir o papel da distrofina no tratamento da Distrofia Muscular de Duchenne. Previamente os pesquisadores já tinham identificado duas formas de utrofina, a B que se expressa nas células endoteliais dos vasos e a A que se expressa na junção neuromuscular, no plexo coróide, na pia máter e no glomérulo renal. Neste trabalho os cientistas analisaram a presença destas duas formas de utrofina em camundongos com distrofia muscular experimental. Os resultados permitiram demonstrar que a utrofina A mas não a B está aumentada no músculo deficiente em distrofina e o mecanismo deste aumento o que poderá contribuir para entender o papel da utrofina e pesquisar formas de aumentar a sua quantidade em músculos com ausência de distrofina.

USA - 180 cientistas e médicos se reuniram no Arizona para discutir os recentes avanços em quatro doenças neuromusculares.

 Com relação a distrofia muscular de Duchenne os assuntos abordados foram:

-  as vantagens do tratamento com cortícoides para retardar a evolução da doença mas a necessidade de acompanhamento períódico para prevenção dos seus efeitos colaterais; foram discutidos esquemas de tratamento (diário, semanal, 10 dias com e 10 dias sem) e tipos de corticóides empregados (prednisona, deflazacort). 

- quando e por que realizar cirurgias ortopédicas 

- avanços na pesquisa da melhor forma de terapia gênica na distrofia muscular de Duchenne: que parte do gene é necessária, qual o melhor vírus para levar o gene, etc

- métodos para melhorar o diagnóstico da doença

Com relação a distrofia tipo cinturas foram abordados os seguintes assuntos:

- foram relatados os resultados de dois pacientes que receberam injeção do gene da sarcoglican no pé; uma apresentou pequena expressão da proteína enquanto o outro não. Estes resultados não foram conclusivos já que os pacientes com esta forma de distrofia podem apresentar a expressão do gene nos músculos do pé. Outros estudos serão realizados em breve.

- melhores formas de diagnosticar a doença podendo contribuir para esclarecer a evolução da doença de acordo com a alteração genética apresentada.

http://www.mdausa.org/news/021113phyreview.html

http://www.mdausa.org/news/021115sperep.html

USA -  Utilizando células tronco adultas  os cientistas da Universidade de Stanford conseguiram pela primeira vez demonstrar como, passo a passo, as células tronco se transformam em músculos. As células tronco, neste estudo publicado na revista Cell desta semana,  se transformaram em verdadeiros músculos prontas para corrigir músculos lesados. A pesquisa não utilizou camundongos com distrofia muscular mas a finalidade deste estudo é o entendimento de como tratar esta doença com células tronco. Inicialmente para realizar estes sofisticados experimentos os cientistas destruiram a medula óssea de camundongos com irradiação. Em seguida eles injetaram células tronco de um outro camundongo, modificado geneticamente para produzir uma proteína fluorescente, que poderia ser vista no microscópio. Após alguns meses eles detectaram células tronco específicas dos músculos, denominadas de células satélites, com coloração fluorescente em todo camundongo, demonstrando de fato que elas teriam se originado das células tronco transplantadas. Na parte mais interessante do trabalho eles dividiram os camundongos em dois grupos: um sedentário e outro que fazia constante atividade física (andar em rodas). Os camundongos que andaram cerca de 4 milhas por noite por seis meses brilhavam com mais intensidade que os outros, como se estivessem severamente lesados. Mas os pesquisadores observaram que as células tronco tinham se multiplicado e transformado em fibras musculares com capacidade de reparar a lesão muscular. Os camundongos sedentários também apresentaram células tronco músculo específicas fluorescentes mas os que tinham feito atividade física tinham 20 vezes mais fibras musculares. É provável, pelos resultados observados, que as células lesadas enviaram alguma forma de mensagem para atrair, multiplicar e diferenciar as células tronco. A descoberta desta forma de sinal pode ser muito útil no tratamento das doenças neuromusculares como as distrofias musculares. 

Austrália -  em um trabalho anterior este grupo de pesquisadores australianos tinha demonstrado que o uso da fator inibidor da leucemia melhoravas as alterações musculares da distrofia muscular. Nesta continuação da pesquisa que será publicada em breve na revista Neuromuscular Disorders eles observaram que este fator aumenta a proliferação dos mioblastos mas não reduziu as  alterações produzidas no músculo com distrofia muscular não demonstrando nenhum benefício significativo.

An evaluation of leukaemia inhibitory factor as a potential therapeutic agent in the treatment of muscle disease

The exogenous delivery of growth factors and cytokines is a potential therapeutic strategy to alleviate the degenerative effects of  primary inherited myopathies such as Duchenne muscular dystrophy. The mdx mouse diaphragm is a model for examining the progressive degeneration of dystrophic muscle. We have delivered leukaemia inhibitory factor to the mdx diaphragm using slow release alginate gels. Previous studies have reported an improvement in the histology of mdx diaphragms after delivery of leukaemia inhibitory factor in a similar manner, but little attention has been paid to the mechanism by which leukaemia inhibitory factor acts. We have used autoradiography to examine cell proliferation, Evans Blue Dye to examine myofibre damage, and morphometric analysis to examine histology in leukaemia-inhibitory-factor-treated diaphragms and compared them with untreated mdx and normal C57Bl10/ScSn diaphragms. Autoradiography showed that although myoblast proliferation was significantly increased in leukaemia inhibitory factor-treated mdx diaphragms, leukaemia inhibitory factor did not reduce myofibre damage and no histological improvement was observed. The data presented here, while demonstrating a role for leukaemia inhibitory factor in myoblast proliferation, do not support a strong and consistent benefit of leukaemia inhibitory factor on dystrophic muscle in vivo as a means of alleviating the effects of chronic dystrophic muscle degeneration.

Austrália - uma das formas de terapia gênica que estão sendo estudadas na distrofia muscular é a utilização de oligonucleotídeos; ao invés de substituir o gene defeituoso se utiliza uma sequência pequena de nucleotídeos com a finalidade de fazer a célula vencer o defeito genético e passar a produzir uma forma de distrofina com um pequeno defeito mas funcionante. Esta forma de tratamento está sendo testada em vários centros no Japão, Cingapura e na Austrália; há vários relatos anteriores desta técnica no itém antisense (http://www.distrofiamuscular.net\notisense.htm).  Nesta pesquisa em células de camundongo com distrofia os cientistas produziram várias  sequências de oligonucleotídeos que demonstraram sucesso e com menor tamanho e com resultados  mais efetivos com as células passando a sintetizar a proteína distrofina.

Canadá -  pesquisa apresentada por um grupo canadense no Congresso Americano de Cardiologia demonstrou que a terapia gênica é eficiente em pacientes com infarto do miocárdio. Utilizando a injeção do gene do hormônio de crescimento diretamente no músculo cárdiaco de pacientes que foram comparados aos que recebiam a medicação convencional. Após 3 meses não havia diferença entre os grupos mas após 6 meses os que receberam terapia gênica apresentavam condição cardíaca muito melhor.

Inglaterra - na opinião destes pesquisadores os corticóides são a unica forma de tratamento paliativo com medicações na distrofia muscular de Duchenne. Muitos médicos não o utilizam por receio dos efeitos colaterais. Não se comprovou claramente como atua o corticóide na doença e por isto eles iniciaram uma pesquisa para identificar os possíveis mecanismos envolvidos como a melhora ( estudos genéticos) e tentar evidenciar alguma outra forma de tratamento que tenha o mesmo resultado e com menos efeitos colaterais. O artigo publicado na Revista Neuromuscular Disorders tem o seguinte resumo original:

Steroids in Duchenne muscular dystrophy: from clinical trials to genomic research

Francesco Muntonia,*, Ivan Fishera,b,c, Jennifer E. Morganb, David Abrahamc

Abstract

Steroids represent the only pharmacological palliative treatment for Duchenne muscular dystrophy. However, they do have side effects and despite a large number of published studies showing their efficacy, they are still not universally used. This is largely due to the lack of functional outcome and quality of life measures in most of the published studies and suggests that further trials might be required to answer some of the still unclear aspects of their role. Another important aspect of steroid therapy in Duchenne dystrophy is that we do not know how they work in dystrophic muscle. We have initiated a collaborative study on gene profiling using microarray in steroid-treated mdx mice. cDNA microarray studies were performed to examine the levels of skeletal muscle gene expression in a pool of mdx mice treated with prednisolone for 1 and 6 weeks. Interesting preliminary data on untreated mdx mice suggest that the gene profiling of young (7 weeks) versus older (12 weeks) mice is very significantly different. Furthermore, a large number of genes showed significant changes in expression at the mRNA level on treatment with prednisolone. These included structural protein genes; signalling genes and genes involved in immune response. Hopefully, analysis of this pattern of steroid-induced gene expression will provide some insight into understanding how glucocorticoids improve strength in Duchenne dystrophy, and may help in developing more effective and less toxic therapeutic approaches.

USA - será publicado em dezembro o artigo já divulgado no site em 12/07/2002 sobre a criação de um camundongo que não produzia a miostatina; a ausência desta proteína causa redução das degeneração muscular na distrofia muscular experimental; a pesquisa de drogas que possam inibir a miostatina pode ser o caminho para um tratamento medicamentoso da distrofia muscular. A repercussão deste artigo está aqui e aqui. O boletim da Johns Hopkins está aqui.

USA - coincidentemente mais um artigo sobre a miostatina será publicado hoje. Neste estudo os cientistas utilizaram um anticorpo monoclonal para impedir a ação da miostatina e conseguiram reduzir a severidade das alterações musculares na distrofia muscular experimental. Este estudo apresenta resultados semelhantes aos do artigo anterior (24/11/02) com a vantagem de não necessitar de terapia gênica (o anticorpo é injetado e impede a ação da miostatina); não se determinou as consequências a longo prazo do bloqueio da miostatina. 

O resumo do artigo publicado na Nature segue abaixo:

Functional improvement of dystrophic muscle by myostatin blockade

Nature 420, 418 - 421 (2002); doi:10.1038/nature01154

SASHA BOGDANOVICH*†, THOMAS O. B. KRAG*†, ELISABETH R. BARTON*, LINDA D. MORRIS*, LISA-ANNE WHITTEMORE‡, REXFORD S. AHIMA§ & TEJVIR S. KHURANA*

* Department of Physiology and Pennsylvania Muscle Institute, University of Pennsylvania School of Medicine, 3700 Hamilton Walk, Richards A-601, Philadelphia, Pennsylvania 19104-6085, USA
‡ Musculoskeletal Sciences Department, Wyeth Research, Cambridge, Massachusetts 02140, USA
§ Division of Endocrinology, University of Pennsylvania School of Medicine, Philadelphia, Pennsylvania 19104, USA
† These authors contributed equally to this work

Correspondence and requests for materials should be addressed to T.S.K. (e-mail: [email protected]).

Mice and cattle with mutations in the myostatin (GDF8) gene show a marked increase in body weight and muscle mass, indicating that this new member of the TGF- superfamily is a negative regulator of skeletal muscle growth. Inhibition of the myostatin gene product is predicted to increase muscle mass and improve the disease phenotype in a variety of primary and secondary myopathies. We tested the ability of inhibition of myostatin in vivo to ameliorate the dystrophic phenotype in the mdx mouse model of Duchenne muscular dystrophy (DMD). Blockade of endogenous myostatin by using intraperitoneal injections of blocking antibodies for three months resulted in an increase in body weight, muscle mass, muscle size and absolute muscle strength in mdx mouse muscle along with a significant decrease in muscle degeneration and concentrations of serum creatine kinase. The functional improvement of dystrophic muscle by myostatin blockade provides a novel, pharmacological strategy for treatment of diseases associated with muscle wasting such as DMD, and circumvents the major problems associated with conventional gene therapy in these disorders.

Comentários da revista sobre o artigo: Myostatin is a negative regulator of muscle mass — a mutant myostatin is responsible for the exaggerated musculature in Belgian blue cattle. Blockade of myostatin activity in the mdx mouse model for Duchenne muscular dystrophy with a monoclonal antibody is now shown to improve muscle function and cause a significant increase in muscle size. Myostatin blockade would be an attractive strategy for treating muscle degeneration diseases, as it would avoid some of the problems associated with conventional gene therapy 

Inglaterra - a identificação dos genes envolvidos nas diferentes formas de distrofia tem ocorrido nos últimos 15 anos; nos últimos 18 meses muitas avanços tem ocorrido no sentido de identificar como as alterações musculares ocorrem. Defeitos da  glicosilação (cobertura com açucar) de proteínas de membrana celular podem acarretar algumas das alterações observadas  em várias formas de distrofia muscular (como a distrofia tipo cinturas). A correção deste defeito da glicosilação pode se constituir em uma nova forma de tratamento.

Defective glycosylation in muscular dystrophy 

Francesco Muntoni  (e-mail:[email protected]), Martin Brockington, Derek J Blake, Silvia Torelli, Susan C Brown Lancet 2002; 360: 1419-21 

Context Over the past 15 years the causative genes of several inherited muscular dystrophies have been identified. These genes encode sarcolemmal, extracellular matrix, sarcomeric, and nuclear envelope proteins. Although the post-translational processing of muscle proteins has a significant role in their correct assembly and function, these processes have not been shown to be primarily involved in the pathogenesis of muscular dystrophies until recently. In the past 18 months, four different forms of inherited muscular dystrophy in human beings have been associated with mutations in genes encoding for putative glycosyltransferases. Aberrant glycosylation of alpha-dystroglycan, an external membrane protein expressed in muscle, brain, and other tissues, is a common feature in these disorders. alpha-dystroglycan is highly glycosylated, its sugar components varying in different tissues and controlling its interaction with extracellular matrix partners. Disrupted glycosylation of alpha-dystroglycan results in a loss of these interactions, giving rise to both progressive muscle degeneration and abnormal neuronal migration in the brain. 

Starting point Kevin Campbell and colleagues have recently demonstrated that patients with muscle-eye-brain disease (MEB) and Fukuyama congenital muscular dystrophy (FCMD), as well as the myodystrophy (myd) mouse, have an abnormally glycosyated form of alpha-dystroglycan (Nature 2002; 418: 417-22 and 422-25). The abnormally glycosylated protein did not bind to three of its extracellular matrix ligands, laminin alpha2 chain, agrin, and neurexin. The investigators also showed that a neuronal migration disorder occurs in both the myd mouse and in a brain-restricted alpha-dystroglycan knock-out mouse that is similar to that seen in patients with MEB and FCMD. These results identify alpha-dystroglycan as having an essential role in both muscle and brain development and function.

Where next Emphasis is moving away from identifying the protein components of the muscle fibre that are involved in muscular dystrophies towards the post-translational processing of proteins and the enzymes involved in these modifications. This opens up new avenues of research. Abnormal glycosylation of alpha-dystroglycan may underlie other as yet uncharacterised forms of muscular dystrophy and neuronal migration disorders.

Suiça e Inglaterra: a bactería E.coli é uma fábrica produtora de proteínas para o homem (como a insulina, hormônio de crescimento, etc). No entanto ela não tem a capacidade de glicosilar proteínas. Como explicamos no artigo acima o defeito glicosilação de proteínas pode desencadear algumas formas de distrofia muscular e outras doenças clínicas (como a artrite reumatóide). Neste estudo os pesquisadores transferiram  o sistema responsável pela glicosilação de proteínas da bactéria Campilobacter jejuni para a E.coli. Com isto a E.coli passará a produzir as proteínas glicosiladas e poderá servir para estudar como funcionam estas proteínas e como corrigir o defeito nas células humanas.

Austrália - o IGF-1 é um é uma proteína que todos nos temos no nosso organismo e  tem sido testada para aumentar a força muscular de atletas e em estudos experimentais de distrofia muscular. Neste trabalho os camundongos com distrofia muscular receberam a injeção subcutãnea de 1mg/Kg  de IGF-1. Os resultados mostraram que o IGF-1 aumenta a resistência a fadiga dos músculos respiratórios em conjunto com aumento das enzimas energéticas.  Como deficiência dos músculos respiratórios é um fator de mortalidade na Distrofia Muscular de Duchenne o estudo do IGF-1 nesta situação deve ser estimulado.

Inglaterra - a utrofina é uma proteína presente na célula que pode fazer o mesmo efeito da distrofina e melhorar os sintomas da distrofia muscular. Este é mais um trabalho que demonstra os efeitos benéficos da utrofina em um modelo de distrofia muscular em camundongos. O que é diferente neste estudo é que o aumento da utrofina em camundongos foi obtida com a adição do antibiótico tetraciclina na água. O tratamento foi realizado em quatro épocas diferentes: no útero, ao nascimento, 10 e 30 dias após o nascimento. O resultado mostrou menor lesão muscular, não houve alteração da força mas ocorreu aumento significante da resistência muscular. Nos animais tratados com 30 dias do nascimento os resultados foram muito pequenos. Além disso os pesquisadores observaram que os canais de cálcio se normalizaram com a expressão da utrofina demonstrando o papel do cálcio nas alterações musculares da distrofia. Em resumo este trabalho demonstrou que a utrofina pode corrigir as alterações da distrofia, especialmente quando realizada logo ao nascimento e dependendo da quantidade de utrofina das células musculares.

USA -  A Universidade de Stanford anunciou a criação de um fundo de 12 milhões de dólares para pesquisas com células tronco. Este fundo é importante para incentivar outras Universidades a pesquisar as células tronco embrionárias e para vencer a resistência de religiosos e alguns políticos que são contra estas pesquisas.

USA - A Universidade de Minnesota que vem pesquisando a utilização das células tronco em diferentes doenças se associou com a Athersys, empresa de biotecnologia para continuar com as pesquisas e desenvolver o uso comercial das células tronco. 

Alemanha - um grande problema da terapia gênica e do transplante de mioblastos é a resposta imunológica que eles desencadeiam, com inflamação dos músculos. Neste trabalho os pesquisadores estudaram a HLA-G que foi identificada em poucos tecidos e esta envolvida na resposta imunológica. Na presença desta molécula há uma redução da inflamação e  aumenta a sobrevida do transplante de mioblastos e pode se constituir numa importante aliada na terapia gênica e transplante de mioblastos

USA - este encontro anual será realizado em São Francisco de 14 a 18/12/2002. Há poucos trabalhos relacionados a distrofia muscular; os mais importantes estão relacionados abaixo. No primeiro artigo é estudado o papel da TGF-beta no desenvolvimento da fibrose muscular; existem estudo sendo realizados tentando inibir esta proteína para retardar as alterações musculares da distrofia muscular. No segundo trabalho os pesquisadores observaram que as células tronco são atraidas em maior quantidade  para o músculo na lesão aguda do que nas lesões crônicas. O terceiro artigo fala do papel da inflamação no desenvolvimento das lesões musculares da distrofia muscular experimental; os pesquisadores reiteram a opinião que o tratamento desta inflamação no músculo pode retardar a evolução da doença. No último trabalho os pesquisadores discutem as dificuldades em fazer as células tronco se transformarem em células musculares em grande quantidade.

I) TGF-beta triggers the differentiation of myogenic cells toward myofibroblasts: Implication for muscle fibrosis

Y. Li, W. Foster, Y. Chan, B. M. Deasy, T. Payne, T. Horaguchi, N. Badlani, J. Cummins, J. Huard; Dept. of Orthopeadic Surgery, Children's Hospital of Pittsburgh, Pittsburgh, PA

Injured muscle can undergo regeneration; however, the healing process is often inefficient and hindered by progressive fibrosis, which is caused by stimulation of inflammatory factors. Transforming Growth Factor-beta1 (TGF-b1) is considered to be a central factor in fibrotic diseases of the liver, lung, heart, and kidney. Our previous research has found that muscle-derived stem cells are capable of differentiating into myofibroblasts following muscle laceration injury. We also have observed TGF-b1 over-expression in injured skeletal muscle. In this study, we determined that TGF-b1 stimulation can induce myoblasts (C2C12 cells) to express TGF-b1 in an autocrine manner, down-regulate the expression of myogenic proteins, and activate the production of fibrotic-related proteins in vitro. In addition, direct injection of human recombinant TGF-b1 into skeletal muscle in vivo was found to stimulate myogenic cells, including myofibers, to express TGF-b1 and subsequently induce scar tissue formation within the injected area. These results demonstrate that TGF-b1 is a key factor that can initiate the fibrotic cascades in skeletal muscle and induce a population of myogenic cells, which includes myofibers, to de-differentiate into myofibroblastic cells in injured muscle. These observations shed new light on the process of scar tissue formation, which commonly occurs in injured and diseased muscle.


II) Side population stem cells are recruited to sites of acute but not chronic muscle degeneration

K. A. Lapidos, E. M. McNally; Cardiology, University of Chicago, Chicago, IL

Muscular dystrophies are degenerative disorders in which skeletal muscle undergoes chronic cycles of degeneration and regeneration. Stem cells are a critical component of the regenerative process. Recently, a pluripotent population of stem cells has been isolated from bone marrow and muscle of adult mice, and these side population (SP) cells were shown to regenerate hematopoietic lineages and skeletal muscle. Based on their ability to differentiate into both cell types, we hypothesized that SP cells comprise an in vivo, stable stem cell compartment available for the regeneration of muscle tissue or the hematopoietic lineages. For example, in muscular dystrophy, a high demand for stem cells in the muscle promotes recruitment of SPs from the bone marrow. Over time, this may result in a quantifiable decrease in SP cells from bone marrow and a quantifiable, concomitant increase at the muscle. We tested this hypothesis by quantifying the percentage of SP cells obtained from bone marrow or muscle in a chronic model of muscular dystrophy, g-sarcoglycan null mice (gsg-/-). Whole bone marrow and lower limb skeletal muscle were isolated from wild type and gsg-/- mice at either 6 weeks or 6 months of age. Using the Hoechst dye exclusion technique, SPs from bone marrow (HSPs) and muscle (MSPs) were quantified. We found no statistically significant differences between the mutant and wild type mice. We also studied an acute model of muscle degeneration elicited by cardiotoxin injection of the crural muscles of normal mice. Three days post-injection, SP cells showed a five to nine-fold increase in MSPs in cardiotoxin-treated versus the control. In conclusion, we have shown that side population cells increase at the site of acute, but not chronic, muscle degeneration/regeneration.

III) Staging Interactive Pathogenic Mechanisms in mdx Mouse Dystrophinopathy by Temporal Gene Expression Signatures

J. D. Porter, A. P. Merriam, S. Khanna; Ophthalmology, Case Western Reserve University, Cleveland, OH

Although Duchenne muscular dystrophy (DMD) results from mutations of dystrophin, multiple interactive mechanisms likely contribute toward pathogenesis. We used Affymetrix oligonucleotide arrays to compare hindlimb muscle of the mdx mouse dystrophinopathy to wild type mice at postnatal (P) ages 7, 14, 18, 23, 28, 56, and 112 days; 3 independent replicates/age/strain. Extraocular muscle, which shows no signs of pathology in dystrophinopathy, also was studied at most ages. Patterned alterations in hindlimb gene expression between P7 and P14 (prenecrotic stage) included only 8 genes. Rapid accumulation of expression changes was observed thereafter, with a 20-fold increase in the number of up-regulated genes between P14 and P28, which coincided with appearance of histologic changes in muscle. Assessed at the expression level, disease peaked with 376 differentially regulated genes at P56, but a persistent response was evident at P112 (~130 genes). Correlation analyses provided insight into the interactive nature of inflammatory, fibrotic, and muscle regenerative events, with proinflammatory mechanisms particularly evident. By contrast, few changes were detected in extraocular muscle at any age. Immunocytochemistry and quantitative PCR for chemotaxic molecules confirmed their early role in recruitment of an inflammatory infiltrate to dystrophic muscle, along with a corresponding absence in extraocular muscle. These findings suggest that inflammation is a key contributor to, rather than a consequence of, the pathogenesis of dystrophin deficiency. The absence of changes in extraocular muscle suggest that this tissue does not adapt, but rather is constitutively protected in muscular dystrophy. Taken together, genome-wide expression profiling establishes an integrated profile of dystrophinopathy and the resultant mdx temporal expression signature for hindlimb suggests that blockade of inflammatory cell recruitment may be effective in ameliorating the disease, an attractive prospect in the absence of effective therapy for the primary mutation.

IV) Migration and Fusion of Muscle SP Cells into Dystrophic Myofibers

R. L. Sohn,1 E. Gussoni2 ; 1 Medicine/Cardiology, Brigham and Women's Hospital, Boston, MA, 2 Division of Genetics, Children's Hospital, Boston, MA

Cell therapy with muscle SP cells in animal models is being explored as a potential treatment for muscular dystrophy. However, though promising, stem cell therapy is plagued by its low efficiency: only about 1-5% of these stem cells fuse into pre-existing myotubes. In fact, how myoblasts, or even muscle SP cells, fuse to form multinucleate myotubes is a fascinating and highly regulated process. Recent work in Drosophila has elucidated some of the molecular components of this process. Our hope is to improve the efficiency of cell therapy with muscle SP cells by utilizing the tools and concepts of myoblast fusion found in Drosophila. As a first step, we have looked for cell surface markers that promote the migration of SP cells from the blood where they are injected to skeletal muscle where they then fuse into myotubes. Chemokines are known to play major roles in leukocyte migration. Therefore, we looked for the presence of chemokine receptors in skeletal muscle. By immunohistochemistry on human fetal skeletal muscle, we have found cells positive for the chemokine receptor CXCR-4 along the myofibers. These are not satellite cells as they are not positive for the transcription factor Pax-7. We have also found myotubes positive for CDO (CAM-regulated, down-regulated by oncogenes), a cell surface protein of the immunoglobulin/fibronectin type III repeat family that has been found to positively regulate myogenic differentiation in vitro (Kang, et al. 1998, JCB 143: 403-13). Work is currently underway to determine if these cell surface proteins are also present in muscle SP cells. If so, it is possible that by increasing the expression of these molecules, we will be able to also increase the efficiency of the SP cells to migrate to muscle and to fuse into the myotubes.

USA - a ViaCell uma empresa líder no estudo das células tronco umbilicais apresentou no Congresso da Sociedade Americana de Hematologia sua técnica de expandir o número de células tronco e preservá-las para o uso terapêutico. As células são criopreservadas (conservadas em baixissimas temperaturas) e não perdem a sua função. Estas células poderão ser utilizadas em doenças do sangue, doenças genéticas, etc.

Researchers at ViaCell Report Additional Successes in Expanding And Preserving Stem Cells from Umbilical Cord Blood for Use in Cellular Therapies NEW

BOSTON, Dec. 18 /PRNewswire/ -- ViaCell, Inc., a premier cellular therapy company, has presented study results demonstrating its ability to expand and preserve purified stem cell populations from umbilical cord blood for future potential use as cellular medicines. Scientists from ViaCell presented data on these as well as other research and development advancements at the recent American Society of Hematology's 44th Annual Meeting in Philadelphia, PA. Among the findings, scientists showed that populations of human umbilical cord blood stem cells that are expanded using ViaCell's patented Selective Amplification(TM) technology can be successfully cryopreserved without any significant loss of function. In a mouse model, these cells were shown to engraft successfully in transplant procedures at a rate that is comparable to that achieved by selectively amplified cells that were not frozen. Study findings indicate that these stem cells can be manufactured and cryogenically frozen in significantly large populations for future use as cellular medicines. "Umbilical cord blood stem cells are used as a part of the therapy regimen for nearly 50 diseases today. One of the challenges in developing additional cellular therapies is the need to multiply and preserve large quantities of these powerful umbilical cord blood stem cells for use in treating an even broader range of diseases. These important studies indicate that we can substantially increase the number of these valuable cells and freeze them for later use," said Jan Visser, Ph.D., senior vice president, head of science at ViaCell. Scientists also reported the ability to control various expression patterns while reproducing a targeted population of umbilical cord blood stem cells using Selective Amplification(TM). The ability to monitor specific cell receptors and ligands offers the potential to engineer specific, homogeneous and high-potency pools of hematopoietic stem cell candidates in large quantities. Data also presented show that the presence of the growth factor thrombopoietin (TPO) in combination with other agents significantly increases the generation of both long- and short-term repopulating stem cells. These findings are now being applied in ViaCell's Selective Amplification(TM) process to expand target populations from various stem cell sources such as bone marrow or cord blood. This is expected to result in the increased production of human hematopoietic stem cell candidates. "We anticipate that these new studies will show that TPO can further enhance production of human hematopoietic stem cells for use in transplantation therapy," added Dr. Visser. Additionally, research progress on the effects of insulin-like growth factor binding protein-3 (IGFBP-3) in modulating the proliferation of primitive stem cells indicates that IGFBP-3 also serves an important function in blocking cell differentiation. The ability to prevent stem cells from differentiating into other cell types could enhance the ability to grow highly enriched populations of stem cells with broad applications in human health. ViaCell first announced the discovery of this protein's impact on regulating the expansion and engraftment potential of human stem cell populations at the 2001 American Society of Hematology's Annual Meeting. "These critically important studies significantly expand ViaCell's history of research discoveries and advances in support of our mission to develop and provide the highest quality cellular therapies for the treatment of many challenging human diseases," said Marc Beer, president and CEO of ViaCell. "The progress reported here contributes significantly to the rapidly evolving field of cellular medicine and therapeutic development." "Our research and development strides presented at this year's American Society of Hematology meeting represent a few of the important accomplishments the ViaCell team has achieved in furthering cellular therapy," said Dr. Visser. "Our progress in areas including other growth factors, antibodies, endogenous stem cell stimulants, pancreatic stem cell and pancreatic islet isolation and expansion methodologies underscores our commitment to the development of innovative cellular therapies to tackle numerous unmet clinical challenges."

Itália e Suíça - Pesquisas tem sido realizadas para encontrar tratamentos paliativos para as distrofias musculares com mínimos efeitos colaterais. Pesquisadores estudaram a taurina e a creatina, drogas que podem reduzir a degeneração muscular e a IGF1,droga que pode aumentar a regeneração muscular, em um  modelo experimental de distrofia muscular em camundongos. A droga foi administrada por 4 a 8 semanas e os camundongos foram submetidos ao exercício para acelerar as alterações musculares. Efeitos benéficos foram obtidos com a taurina e a IGF-1 demonstrando um potencial destas drogas no tratamento da distrofia muscular.

 

Brasil - hoje pela manhã foi inaugurado o canil da Faculdade de Veterinária da USP que servirá para abrigar os cães ligados a pesquisa envolvendo as células tronco e distrofia musculares. A equipe da Faculdade de Veterinária está sensibilizada com a causa da distrofia muscular e promete se envolver completamente com as pesquisas. Há vários subprojetos utilizando as células tronco de cordão umbilicial, medula óssea e placenta. As pesquisas ocorrerão em São Paulo e no Centro de Terapia Gênica de Ribeirão Preto da AADM.

 

USA - em março de 2001 quando iniciamos o site divulgamos uma promissora notícia sobre uma nova modalidade de terapia gênica: a utilização do gene da alfa 7 beta 1 integrina no tratamento de um modelo experimental de distrofia muscular. O artigo veio ilustrado por um interessante  vídeo das pesquisas (http://www.jcb.org/cgi/content/full/152/6/1207/DC1/1) (para visualização do vídeo que tem 11,5MB, você precisa do quick time player). Após 21 meses não houve nenhuma continuidade da pesquisa e nenhum outro pesquisador realizou estudos nesta mesma linha. 

USA - Stephen Kaufman, cientista que está estudando a integrina no tratamento da distrofia muscular enviou a seguinte resposta a Berit Sofie a respeito de sua pesquisa: que a integrina é uma alternativa interessante e promissora no tratamento da distrofia muscular; que ele continua estudando o tema e que ele acredita que outros pesquisadores estejam estudando o tema e que há um caminho ainda longo para os testes em seres humanos.

"Dear Berit,
In the article you refer to we report an interesting and encouraging alternative approach to DMD. We continue to work on this and I believe other labs may also have taken this cue.  At this point, unfortunately, we are years away from knowing whether this approach will lead to a meaningful clinical intervention in humans.  I assure you we continue to work on this diligently.
Sincerely,
Stephen Kaufman"

Japão - a distrofia de Duchenne e Becker são formas de distrofia muscular ligada a um mesmo gene defeituoso. Em alguns casos a diferenciação da forma de distrofia é difícil clínicamente, sendo denominadas de formas intermédiárias da doença. Em um paciente com esta forma intermédiária os linfócitos foram estudados sendo encontrados três formas de mRNA, a estrutura da célula responsável pela transcrição das informações do DNA para a síntese de proteínas. A presença de 3 mRNA promoverá a criação de três formas de proteínas defeituosas e pode ser o motivo desta forma intermediária. O estudo do mRNA poderá se constituir em uma nova forma de tratamento do defeito genético, que poderá atenuar os sintomas das formas mais severas de distrofia muscular.

Um dos maiores problemas da terapia gênica é a capacidade de levar o gene até a célula e fazé-lo funcionar. Neste estudo em células musculares de porcos os pesquisadores utilizaram um vírus para levar o hormônio de crescimento para as células. Para melhorar a eficiência desta terapia eles utilizaram uma corrente elétrica de baixa intensidade. Através desta corrente elétrica foi possível  utilizar pequena quantidade de vírus. O estudos realizados mostraram que o gene passou a realizar o seu efeito: houve aumento do peso, diminuição da gordura e aumento da densidade óssea. O estudo comprovou que a corrente elétrica otimiza a terapia gênica.

Muitas pesquisas importantes divulgadas em 2001/2002 não tiveram continuidade ou delas não tivemos mais notícias. Pais de portadores de distrofia estão entrando em contato com pesquisadores para solicitar mais informações ou para mostrar aos cientistas que os pais estão com pressa nas pesquisas. A nossa amiga Julie Garcia da Califórnia conseguiu uma resposta do Dr. Eric van Lunteren sobre a pesquisa com o uso de inibidores dos canais de potássio na distrofia muscular experimental (Inotrophic effects of the K(+) channel blocker TEA on dystrophic (mdx and dy/dy) mouse diaphragm). Neste e-mail  Eric responde que não tem informações sobre o uso de bloqueadores dos canais de potássio na distrofia muscular e não sabe dizer se serão usados clinicamente. Ele faz pesquisas básicas e não está envolvido com o tratamento de pacientes com distrofia muscular. 

Pesquisadores de ciências básicas não sabem muito sobre as distrofias musculares e sobre a necessidade de urgência nas pesquisas.

I am not aware of any data on the use of K+ channel blockers for the treatment of humans with muscular dystrophy, so I really can't tell you how useful this will turn out to be clinically.  Although I do basic research in this area, I am not very involved in the clinical treatment of people with muscular dystrophies.  Thus it is possible that there may be some information along the lines you are seeking without my being aware of it.  Sorry I can't be of much help beyond this.

Erik van Lunteren

A nossa amiga Berit Sofie da Noruega conseguiu a seguinte resposta do Dr. Jeffrey S Chamberlain que tem uma linha de pesquisa muito sólida em distrofia muscular e é um dos pesquisadores mais dedicados na pesquisa da cura da doença com a terapia gênica.

Gene therapy of muscular dystrophy

Adeno-associated virus vector-mediated gene transfer into dystrophin-deficient skeletal muscles evokes enhanced immune response against the transgene product

Functional correction of adult mdx mouse muscle using gutted adenoviral vectors expressing full-length dystrophin

Neste e-mail o Dr. Chamberlain afirma que o objetivo de seu laboratório. O principal foco de pesquisa é como levar o gene para o tratamento. Os problemas para a efetivação da terapia gênica mas estão sendo feitos progressos. Ela faz pesquisas com camundongos que tem uma doença semelhante à humana. A administração do gene antes do desenvolvimento da doença pode prevenir a sua ocorrência. Ele está também pesquisado os efeitos da terapia gênica em camundongos que já apresentam alterações musculares tentando reverter os sintomas da doença. As pesquisas são divididas em três etapas. Primeiramente ele esta estudando transportadores do gene até o músculo. Segundo ele está pesquisando maneiras de avaliar corretamente a força muscular e analisar o resultado da terapia gênica. Terceiro ele está fazendo formas diferentes de distrofina, pequenas e grandes e colocadas em diferentes transportadores. Ele usa vírus como transportadores do gene, que são preparados em laboratórios sendo retirados genes do vírus que podem causar efeitos ruins. Ele tem bons resultados com dois vírus que já provaram sua capacidade em transportar o gene da distrofina aos músculos. Importante é que este processo pode acarretar lesão muscular que pode ser em parte revertida. A importância deste trabalho é que esta forma de terapia gênica demonstrou capacidade de reverter as alterações já existentes no músculo, o que abre a perspectiva de cura da doença mesmo com a lesão já estabelecida. Ele enfatiza que todos os estudos são feitos em camundongos e não há testes seguros em seres humanos. Ele também explica que os trabalhos demonstram efeito em um músculo e outros estudos deveram ser feitos para tratar todos os músculos. Ele acredita que iniciará estudos em seres humanos nos próximos 2 a 3 anos para testar a segurança do procedimento. Ele termina relatando que tem um grupo dedicado e que está trabalhando intensamente para resolver os problemas da terapia gênica.

Dear Berit,

Thank you for your interest in our work.  The goal of our lab, and many others, is to find a way to use gene therapy to treat muscular dystrophy.  Our main focus is on Duchenne Muscular Dystrophy (DMD), but we feel that the methods used to deliver a gene to muscle should be generally applicable to most types of muscular dystrophy.  The difficulties in developing gene therapy are many, but we are making good progress.  The studies now being performed all use animal models for muscular dystrophy.  My lab studies a strain of mice that have the same genetic defect as do patients with DMD.  These mice therefore allow us to test many potential approaches for therapy.  Previous work in mice has shown that if a new dystrophin gene can be delivered to muscle before the disease develops, that dystrophy can be prevented from occurring.  However, we are also interested to find out whether it might be possible to halt the disease, or even reverse some of the muscle damage, after the disease has already developed.  
We have taken several approaches to answering these questions.  First, we have been developing ‘shuttles’ that allow genes to be transferred into muscle cells.  Second, we have been developing ways to measure muscle function in the mice, so that we can find out what effects gene transfer has on muscle.  Third, we have been making many different types of dystrophin genes, both large and small versions, so that we have available several options to use with our different shuttles.  The shuttles are made from viruses, but first we remove from the virus those genes that might otherwise cause illness.  We have obtained encouraging results with two shuttles, adeno-associated virus, and adenoviral shuttles, each of which have been stripped of all viral genes.  Our most recent studies showed that the so-called “gutted’ adenoviral shuttle could transfer the full dystrophin protein to muscle cells.  Importantly, we found that when the gene was delivered to muscles of mice that had already developed a lot of muscle damage, we were able to reverse some of that damage. The importance of this work is that we now know that if the dystrophin gene and protein can be replaced in muscles, then it should be possible to not only halt the disease from getting worse, but also to reverse at least some of the pre-existing muscle damage.
It is important to remember that all of this work has been done in mice.  Also, the shuttles we are using have not been fully tested for their safety in humans.  Third, at present we are able to treat only a fairly small amount of muscle, even in the mice.  Thus, we still have a lot of work to do before we can hope to apply these results to patients.  We are continuing to test the safety of the shuttles, and we are working hard to find ways to deliver them to all the muscles of the body.  It is likely that we will be able to begin some very limited human clinical trials in the next 2-3 years that will be intended to test safety, and safety alone. We hope to use the adeno-associated virus vector in these studies.  If those studies go well, and if we can improve our methods to deliver shuttles to muscle, we would then be in a position to begin trying to improve muscle strength in patients.  I hope this work can proceed quickly, but it is very difficult work and very time consuming.  Nonetheless, I have a very dedicated group of scientists working extremely hard on these problems.

 With best wishes

Jeffrey S. Chamberlain, Ph.D. 

USA - células do cordão umbilical são congeladas e podem ser úteis no tratamento de doenças hematológicas como as leucemias e os linfomas. Além disso as células tronco do cordão umbilical poderão ser úteis também no tratamento de doenças genéticas como a distrofia muscular. Os pesquisadores estudaram células umbilicais que tinham sido congeladas por mais de 15 anos e observaram que elas continuavam viáveis e poderiam ser utilizadas nestas doenças. 

USA -  outros estudos já haviam demonstrado que nos músculos existem células com potencial equivalente as células tronco da medula óssea. Nesta pesquisa os cientistas identificaram dois tipos de células tronco: apenas um destes tipos tem a capacidade equivalente ao das células tronco. A seleção das células musculares com potencial das células tronco auxiliará na terapia gênica.

Itália -  entender como a lesão cardíaca ocorre é importante para prevenir seu aparecimento. Nesta pesquisa os cientistas identificaram uma proteína no músculo cardíaco, a melusina, que é importante para prevenir a dilatação do coração durante a insuficiência cardíaca.

- Reprogramação das células tronco para se transformar em cardiomiócitos nesta pesquisa realizada no Japão os pesquisadores conseguiram reprogramar as células tronco da medula óssea que se transformaram em células musculares cardíacas, com todas as características funcionais destas células. Este procedimento deverá ser estudado na distrofia muscular no futuro.

- Transplante de células tronco da medula óssea em pacientes com doença cardíaca neste trabalho realizado na Alemanha os cientistas injetaram células tronco retiradas da medula óssea do próprio paciente; as células tronco foram injetadas em pacientes que sofreram infarto do miocárdio. Os resultados após 3 a 9 meses do procedimento mostraram melhora da função cardíaca. Há necessidade de acompanhamento dos pacientes por mais tempo e estudar um grande número de pacientes.

As células tronco são consideradas como alternativa futura para o tratamento definitivo das distrofias musculares. Neste artigo os pesquisadores fazem uma revisão dos procedimentos e dificuldades para levar os genes para células tronco atráves de vetores virais. O sucesso deste procedimento será muito importante nas distrofias musculares.

USA - A matriz do cordão umbilical, denominada cientificamente de geléia de Wharton, é rica em células tronco. Esta parte do cordão umbilical é jogada fora após o parto. Estas células tronco foram denominadas de células tronco da matriz  do cordão para diferenciá-las das células tronco do cordão umbilical e demonstraram potencial de transformação em outras células como as nervosas. Se estas células confirmarem seu potencial será uma grande fonte de células tronco para pesquisas. 

Canadá - PharmaGap obteve patente para o desenvolvimento de células tronco a partir de células da pele. Estas células poderão ser utilizadas em doenças de pele e deverão ser estudadas quanto ao potencial de se transformar em outros tecidos. A empresa ressalta que os estudos não utilizam produtos de origem animal evitando os riscos deste tratamento.

USA - o músculo diafragma do camundongo com distrofia muscular demonstra claramente as alterações da distrofia muscular, melhor que os músculos dos membros. Os pesquisadores aumentaram o trabalho do músculo diafragma e demonstraram aumento do dano muscular nos animais. Apesar disto os pesquisadores identificaram células de regeneração do diafragma, em decorrência do dano produzido pelo esforço. O trabalho demonstra que o músculo do camundongo atingido pela distrofia apresenta capacidade de regeneração; estratégias que aumentem a capacidade de regeneração deveriam ser pesquisadas como forma de tratamento.

USA - na revista Quest de janeiro de 2003 é publicado um resumo dos avanços no tratamento das doenças neuromusculares nos últimos anos. Na reportagem é reforçado o papel dos corticóides no tratamento das distrofias musculares. São abordadas superficialmente as pesquisas com a gentamicina, utrofina e células tronco. Com relação as demais distrofias é dada enfase a descoberta dos genes relacionados a várias formas de distrofia o que permitirá desenvolver no futuro melhores formas de tratamento.

Inglaterra - neste artigo de revisão o autor aborda as possibilidades de tratamento das doenças neuromusculares, os avanços realizados e as dificuldades encontradas para fazer com que a maioria das células musculares passem a expressar o gene e permitir a melhora da função muscular.

Japão - o uso de corrente elétrica (electroporation) já demonstrou em outros estudos que aumenta a transferência dos genes para os músculos; neste estudo os pesquisadores demonstraram que a corrente elétrica aumenta a transferência do gene integral da distrofina em grande porcentagem de fibras musculares.

USA - a inibição da  miostatina já demonstrou aumentar a força muscular em camundongos com distrofia muscular. Neste estudo os pesquisadores quiseram testar em camundongos adultos se a inibição da miostatina promoveria o aumento muscular. Os camundongos receberam anticorpo anti-miostatina  e apresentaram aumento da massa e da força muscular. 

USA - pesquisadores americanos promoveram infarto do músculo cardíaco de ratos através da ligação da artéria coronária; 20 minutos após estes animais receberam injeção de células tronco marcadas. Os animais foram estudados 32 semanas após o procedimento. Os resultados demonstraram maior sobrevida após o infarto nos animais que receberam células tronco, e aumento da função cardíaca. As células marcadas foram identificadas como células musculares cardíacas e além disso o número de vasos sanguíneos foi maior nos animais que receberam as células tronco. Este é mais um estudo que mostra a viabilidade do uso das células tronco.

USA - pesquisadores americanos, que foram os descobridores das células tronco, conseguiram pela primeira vez repor um gene nas células tronco. Este procedimento poderá ser muito útil em pacientes com distrofia muscular e é um dos modelos que deverão ser estudados nesta doença: retirar células tronco de pessoas com distrofia, corrigí-las em laboratório e injetá-las nos músculos.

USA -  os estudos recentes tem demonstrado, cada vez mais, que as distrofias musculares são doenças multifatoriais. A ausência do gene da distrofia não consegue explicar todas as alterações da doença. Outros mecanismos secundários (inflamação, isquemia, alteração do metabolismo energético e fibrose)  são importantes para a lesão muscular e tem sido cada vez mais estudados. Há várias evidências que a inflamação pode exercer um papel importante na lesão muscular das distrofias. Os pesquisadores neste estudo  que será publicado em breve na Revista Neuromuscular Disorders decidiram analisar as quemoquinas, móleculas pequenas que são estimuladas na presença de inflamação. Eles constataram aumento destas moléculas nos músculos de camundongos com distrofia muscular, acompanhando outras alterações inflamatórias dos músculos. Desde que o tratamento definitivo não chega estes conhecimentos podem produzir tratamentos paliativos que podem retardar a evolução da doença.

USA - Esta semana foram divulgados os mais de 1500 trabalhos que serão apresentados no Encontro Anual da Academia Americana de Neurologia que realizar-se-á de 29 de março a 5 de abril de 2003 no Hawaii. Destes artigos selecionamos 24 que se relacionam a distrofia muscular e estão relacionados aqui. Os principais são: 

- o artigo número 1 que mostra que os pacientes com Duchenne tratados com corticóides mantém a marcha por mais de 3 anos em relação aos que não usam e tem menor grau de escoliose. Os tratados com corticóides apresentaram maior incidência de fraturas inclusive com compressão vertebral, que pode ser explicada por maior atividade e maior incidência de osteoporose.

- o artigo 2 descreve o uso da ressonância nuclear magnética para avaliar o acometimento dos músculos que será um exame muito utilizado num futuro próximo.

- o artigo 3 demonstra que o ecocardiograma é o melhor exame para avaliar a função cardíaca em mulheres que são portadoras do gene da distrofina  e que a realização do ecocardiograma ao esforço demonstrou anormalidades em 83% das portadoras assintomáticas indicando que elas devam ser acompanhadas para o diagnóstico (as mulheres estudadas estavam com idade entre 37+ 10 anos)

- o artigo 4 descreve um novo vetor para levar o gene até o músculo com bons e prolongados resultados.

- o artigo 5 demonstra os bens resultados da terapia gênica em camundongos utilizando corrente elétrica mas há um declínio da expressão do gene ao longo do tempo que deverá ser estudada; pelo resultado exposto a terapia gênica se bem sucedida deveria ser repetida mais de uma vez.

- o artigo 6 estuda aspectos da lesão muscular da distrofia e o papel dos receptores e do fator de crescimento plaquetário nas lesões observadas.

- o artigo 14 e 15 descrevem alterações no sistema nervoso central de portadores de distrofia miotônica; no artigo 14 são analisadas alrterações na distrofia muscular miotônica congênita que apresentam alterações compatíveis com retardo mental e atraso do desenvolvimento. Não há adequada explicação para estas alterações.

Japão -  trabalhos anteriores já tinham demonstrado o aumento do fator de necrose tumoral em pacientes com distrofia muscular. Neste estudo os pesquisadores japoneses demonstraram que o aumento do fator de necrose tumoral em pacientes com distrofia muscular e em outras doenças inflamatórias musculares pode estar relacionado com a regeneração muscular. Esta pode ser mais linha de pesquisas para o desenvolvimento de drogas que intensificam a regeneração muscular.

Canadá - este grupo canadense está se dedicando a aperfeiçoar o transplante de mioblastos, inclusive em seres humanos. Neste trabalho eles retiraram mioblastos de camundongos com distrofia muscular e no laboratório corrigiram o defeito genético do mioblasto ou seja, utilizando um vetor viral que levou o gene da distrofina até o núcleo dos mioblastos eles conseguiram transformar estas células em normais. Estes mioblastos foram injetados em um músculo da pata do camundongo  que apresentou expressão do gene em porcentagem bem significativa, maior quando os camundongos recebiam drogas imunossupressoras. 

Inglaterra -  modificações dos genes é uma forma em estudo para tratamento das doenças genéticas; no entanto, os métodos que levam os genes até as células ainda não foram aperfeiçoados: há alguns riscos envolvidos e problemas com o uso dos vírus com esta finalidade. Pesquisadores do Imperial College London e da  Medical Research Council da Inglaterra desenvolveram um método efetivo de levar o gene até as céulas sem o uso de vírus.  Eles estudaram em camundongos o uso de microbolhas associadas com o uso do ultrassom. O estouro destas microbolhas, que são injetadas na veia, causa pequenas lesões na membrana da célula e permite a entrada do DNA. O ultrassom é utilizado para direcionar estas microbolhas. Esta terapia que só foi testada em animais pode ser efetiva no tratamento das distrofias musculares.

http://www.health-news.co.uk/showstory.asp?id=107274

http://www.betterhumans.com/News/news.aspx?articleID=2003-02-24-3

Itália -  drogas como o salbutamol e o clenbuterol, ambas classificadas como beta 2 adrenérgicas, tendo sido testadas em várias formas de distrofia muscular. Os pesquisadores identificaram neste trabalho que estas drogas tem propriedades diferentes em relação aos canais de sódio que estão presentes na membrana das células. Com base nesta diferença os pesquisadores identificam o clenbuterol como mais identificado na miotonia do que o salbutamol.

USA - nesta pesquisa realizada pela equipe da Universidade de Pittsburgh os animais deficientes em distrofina no coração receberam injeções no músculo cardíaco de células tronco derivadas dos músculos de camundongos normais. Os animais foram estudados após 2, 4 e 8 semanas deste procedimento. As células sobreviveram no músculo cardíaco e passaram a produzir  distrofina após 4 a 8 semanas do procedimento. Novos estudos serão feitos para avaliar a função cardíaca com este procedimento.

Coréia - a utrofina é uma proteína presente no músculo e tem capacidade de substituir a função da distrofina  na Distrofia Muscular de Duchenne e Becker. O objetivo desta pesquisa foi identificar a utrofina nos músculos de pacientes com Duchenne e tentar correlacionar o seu achado com a regeneração muscular. Os achados foram comparados aos dos músculos de pacientes com miopatia inflamatória. A utrofina estava presente em 94% dos pacientes com Duchenne e em 75% dos portadores de miopatia inflamatória. A porcentagem de fibras com utrofina foi maior na Distrofia de Duchenne, sendo maior nas pequenas fibras de regeneração. Os resultados demonstraram que a utrofina aumenta em fibras musculares de regeneração tanto na Distrofia de Duchenne como nas miopatias inflamatórias; a presença da utrofina foi proporcional  a quantidade de fibras em regeneração.

USA - a eficiência da terapia gênica é significantemente maior com o prétratamento com hialuronidade e a aplicação de corrente elétrica seguida da injeção do plamídeo com o gene da distrofina, processo denominado de de eletrotransferência. Na distrofia muscular de Duchenne há um aumento do tecido fibroso que poderia prejudicar esta terapia. Neste trabalho os pesquisadores demonstram que este processo é possível em células musculares de camundongos com distrofia e que o processo não promove nenhuma lesão adicional no músculo. No entanto a aplicação de hialuronidade previamente não aumenta os resultados deste tratamento. Não há diferença em relação ao sexo e a idade dos camundongos. Portanto este tratamento se mostrou eficiente em laboratório nas células musculares de camundongos com distrofia muscular.

Itália - há muitas semelhanças nas alterações musculares da distrofia e das doenças  inflamatórias. O fator nuclear kB está relacionado a resposta imune, inflamatória  e a  proliferativa do músculo. O objetivo deste estudo foi identificar o papel deste fator nas doenças inflamatórias e genéticas. Os autores estudando músculo de pacientes conseguiram demonstrar a ativação deste fator na Distrofia Muscular de Duchenne. O papel do fator nuclear kB deverá ser melhor estudado. Este artigo será publicado na revista Neurology daqui há 10 dias.

Activation of nuclear factor- kB in inflammatory myopathies and Duchenne muscular dystrophy NEW

M.C. Monici, MD; M. Aguennouz, PhD; A. Mazzeo, MD; C. Messina, MD; and G. Vita, MD

Abstract—Objective: To investigate the immunolocalization and activation of nuclear factor-kB (NF-kB) in polymyositis, dermatomyositis, and Duchenne muscular dystrophy (DMD). Background: NF-kB is a major transcription factor modulating the cellular immune, inflammatory, and proliferative responses. In skeletal muscle it was demonstrated to play a role in the expression of inducible genes in response to oxidative stress and ischemia/reperfusion injury, and also in myonuclear apoptosis and muscle catabolism. Some data suggest that NF-kB may play a role in the pathogenesis of inclusion body myositis. Methods: Muscle samples from five patients each with polymyositis, dermatomyositis, and DMD and 10 normal controls were studied by immunocytochemistry and Western blot of nuclear extracts for the activated form of NF-kB. NF-kB DNA binding activity was studied by electrophoretic mobility shift assay (EMSA). Results: Immunoreactivity for NF-kB was found in the cytoplasm of all regenerating fibers and in 20 to 40% of necrotic fibers. Western blot analysis of nuclear extracts showed a single band corresponding to 65 kd in all patients. EMSA analysis confirmed activation of NF-kB pathway in inflammatory myopathies and, to a lesser extent, also in DMD. Conclusions: These data indicate that nuclear factor-kB pathway is activated in polymyositis, dermatomyositis, and Duchenne muscular dystrophy. It may play a role in modulating the immune response and in regulating myogenesis and muscle repair.

NEUROLOGY 2003;60:993–997 

Bélgica - os pesquisadores tem estudado células tronco originadas da membrana das articulações e já tinham observado que elas podem se transformar em células musculares. Neste trabalho eles injetaram estas células tronco em animais portadores de distrofia muscular e observaram a capacidade destas células em regenerar a musculatura e expressar a distrofina; os animais após o procedimento necessitaram de drogas imunossupressoras.

Inglaterra - utilizando uma técnica já descrita por outros pesquisadores e relatada no site no dia 12/01/03 os pesquisadores ingleses estão tentando com células de portadores de atrofia espinal a correção do mRNA, intermediário entre o DNA e a síntese de proteínas. 

Itália - o fator de crescimento do nervo é expresso também nos músculos e pode estar envolvido na regeneração muscular. Nesta pesquisa os autores estudaram este fator nos músculos de pacientes com Distrofia Muscular de Duchenne e  Becker.  O fator de crescimento do nervo foi identificado nas fibras regenerativas, nos miofibroblastos e nos mastócitos. As outras células, incluindo células de músculos normais e de portadores de miopatia inflamatória não expressavam este fator. Os autores acreditam que este fator possa exercer um papel na regeneração muscular e também no bloqueio da fibrose dos músculos na distrofia muscular.

USA - Cientista americano desenvolve um método de estudo da recuperação celular após a agressão. Ele promove micro lesões na membrana das células e identifica como esta célula trabalha para corrigir este defeito. Este estudo será muito útil na distrofia muscular, segundo o próprio pesquisador, visto que este conhecimento poderá auxiliar na descoberta de novos tratamentos que possam favorecer a recuperação mais rápida das céulas.

USA - muitas pesquisas estão sendo feitas para encontrar a melhor maneira de levar os genes até as células musculares na distrofia. Nesta pesquisa da pesquisadores da Carnegie Mellon University os cientistas estão descrevendo particulas muito pequenas que podem transportar os genes até as células, sem a necessidade de transportadores virais. É uma pesquisa bem inicial mas pode produzir bons resultados.

USA - em artigo a ser publicado na revista Circulation pesquisadores demonstraram que a vitamina C auxilia em laboratório as células tronco se transformarem em células musculares cardíacas. Os cientistas estudaram 880 substâncias, incluindo drogas e vitaminas, e obtiveram resultado positivo com a vitamina C (ácido ascórbico); não há evidência que a ingestão de vitamina C possa ter o mesmo efeito; este experimento foi realizado com células tronco em meio de cultura.

Holanda - uma linha de pesquisa que está sendo desenvolvida na Holanda, Japão, Austrália, Cingapura e outros centros é a da correção do defeito genético; utilizá-se oligonucleotídeos que ajudam a célula a suplantar o ponto de mutação e produzir distrofina. Neste trabalho eles utilizaram células de 6 diferentes pacientes e no laborátorio esta técnica deu excelente resultado: mais de 75 por cento das células passaram a produzir distrofina. A produção se iniciou com 16 horas do processo com pico de 2 dias e se manteve por pelo menos uma semana. Este é um bom caminho para as pesquisas.

Austrália - que o transplante de mioblastos realizado por Peter Law não funciona já se sabia há muito tempo. Nesta trabalho os pesquisadores identificaram  células assassinas que destroem os mioblastos após os o transplante. Bloquear estas células poderá ser uma maneira de tornar o transplante de mioblastos uma forma confiável de terapêutica da distrofia muscular.

USA - neste artigo que será publicado na Revista Neuromuscular Disorders os pesquisadores conseguiram demonstrar que a distrofina tem o mesmo papel na célula muscular cardíaca que ela tem na musculatura esquelética.  A sua ausência é responsável pela doença cardíaca e a sua reposição no músculo cardíaco consegue impedir a doença cardíaca. Portanto o tratamento da distrofia muscular pela terapia gênica deverá proporcionar a correção também da célula muscular cardíaca.

Cardiomyopathic features associated with muscular dystrophy are independent of dystrophin absence in cardiovasculature

T.A. Hainsey, S. Senapati, D.E. Kuhn, J.A. Rafael*

Department of Molecular and Cellular Biochemistry, College of Medicine, The Ohio State University, 410 Hamilton Hall, 1645 Neil Avenue,Columbus, OH 43210, USA

Abstract

The loss of dystrophin results in skeletal muscle degeneration and cardiomyopathy in patients with Duchenne muscular dystrophy. In skeletal muscle, dystrophin strengthens the myofiber membrane by linking the submembranous cytoskeleton and extracellular matrix through its direct interaction with the dystroglycan/sarcoglycan complex. In limb-girdle muscular dystrophy, the loss of the sarcoglycans in cardiovasculature leads to cardiomyopathy. It is unknown whether the absence of dystrophin in cardiomyocytes or cardiovasculature leads to the cardiomyopathy associated with primary dystrophin deficiency. We show here that the cardiomyopathic features of the utrophin/dystrophin-deficient mouse can be prevented by the presence of dystrophin in cardiomyocytes but not in cardiovasculature. Furthermore, restoration of the dystroglycans and sarcoglycans to the cardiomyocyte membrane is not sufficient to prevent cardiomyopathy. These data provide the first evidence that dystrophin plays a mechanical role in cardiomyocytes similar to its role in skeletal muscle. These results indicate that treatment of cardiomyocytes but not cardiovasculature is essential in dystrophinopathies.

Cingapura - pesquisadores retiraram células tronco da gordura de coelhos; estas células foram tratadas em laboratório com várias concentrações de 5-azacitidina e se transformaram em células musculares cardíacas. Este trabalho confirma o potencial das células tronco, em especial as que se originam do tecido gorduroso, que poderá se constituir em uma alternativa para obtenção destas células.

USA - os mecanismos de lesão das células são muito semelhantes em várias doenças, inclusive na distrofia muscular. Nesta pesquisa os autores identificaram pequenas móleculas tóxicas, responsáveis pela morte celular. Elas foram identificadas em doenças totalmente diferentes como o Parkinson e o diabetes. O bloqueio destas moléculas poderá levar a tratamentos de várias doenças degenerativas. 

Austrália - os autores deste artigo que será publicado na Revista Lancet Neurology de maio fazem uma revisão dos tratamento atualmente utilizados na distrofia muscular de Duchenne e fazem um levantamento de todas as pesquisas em andamento com terapia gênica, células tronco, medicamentos, etc. Infelizmente não podemos reproduzir as tabelas do trabalho pois elas são protegidas por direitos autorais.

(Lancet Neurology, 2003, vol. 2, may ) Novel therapies for Duchenne muscular dystrophy: Review

The development of therapeutic strategies that overcome the unique problems posed by Duchenne muscular dystrophy (DMD) has lead to the development of many contemporary approaches to human disease in general. Various treatment approaches have been explored—such as pharmacological therapies and cell-based, cytokine, and genetic therapies—that are all targeted to specific features of dystrophic DMD muscle pathology. In genetic therapies, the large size of the dystrophin gene has necessitated the development and use of novel functional minidystrophin and microdystrophin genes, muscle-specific promoter systems, and gutted adenoviral systems. In addition to these well defined viral strategies, plasmid vectors and the upregulation of utrophin (a dystrophin homologue) have potential. Various novel genetic approaches—such as antisense-mediated exon skipping, gene correction, and new cytokine approaches—are also being developed. Together these exciting developments bring an effective treatment for DMD closer than ever before.

Itália - A utrofina é uma proteína semelhante a distrofina e tem sido usada com sucesso na terapia gênica experimental em camundongos deficientes em distrofina. Os pesquisadores construiram um vírus com um minigene da utrofina e injetaram este vírus no músculo tibial posterior de cães labrador  recém-nascidos (cães com distrofia muscular). Os animais foram estudados 10, 30 e 60 dias após o tratamento, sendo que alguns animais receberam medicação imunossupressora e outros não. Os animais que receberam drogas imunossupressoras expressaram a utrofina por pelo menos 60 dias, tiveram menor quantidade de fibrose e apresentaram aumento das proteínas associadas a distrofina indicando que a utrofina pode compensar a ausência da distrofina. O resultado demonstra que a utrofina pode ser uma alternativa válida para terapia gênica de pacientes com distrofia muscular de Duchenne.

Alemanha - há alguns anos uma pesquisa demonstrou que a administração da gentamicina, um antibiótico, causava expressão da distrofina em um tipo particular de defeito genético, a mutação de ponto. Utilizada em seres humanos ela não demonstrou nenhum efeito e continua sendo testada. Este trabalhou tentou repetir o trabalho original e  não conseguiu demonstrar em camundongos nenhum efeito.

USA -  Pesquisadores de três paises, patrocinados pela Associação Americana de Distrofia (MDA) conseguiram corrigir o defeito genético desencadeante da distrofia muscular miotônica e outras doenças genéticas com mínimos danos à estrutura das células. Nesta forma de distrofia o gene está aumentado pela proliferação de bases (ver detalhes da doença aqui). Os cientistas conseguiram "cortar" estas bases em excesso. Os estudos iniciais mostram alguma melhora da função das células

Canadá - o objetivo do estudo foi avaliar o papel do TNF alfa, um mediador inflamatório na função respiratória.  Os pesquisadores criaram em laboratórios camundongos com ausência genética de TNF alfa. Os camundongos que não expressaram TNF-alfa apresentaram alguns parâmetros de ventilação e força muscular superiores aos demais camundongos, demonstrando que o TNF-alfa exerce um papel na degeneração dos músculos respiratórios na distrofia muscular.

IMPACT OF TNF-ALPHA ELIMINATION ON VENTILATION AND DIAPHRAGM CONTRACTILITY IN DYSTROPHIC MICE NEW

Barkley, J1; Spencer, M2; Farkas, G A.1; McCormick, K M. FACSM1; Gosselin, L E. FACSM1

1University at Buffalo, Buffalo, NY; 2UCLA, Los Angeles, CA

The American College of Sports Medicine Volume 34(5) Supplement 1,May 2002, p S155

Duchenne muscular dystrophy is associated with extensive diaphragm muscle injury and a persistent inflammatory response that leads to muscle degeneration. Ultimately, patients die of respiratory failure by their early twenties. The purpose of this study was to determine if eliminating the inflammatory cytokine tumor necrosis factor-alpha (TNF[alpha]) would improve ventilatory reserve and diaphragm muscle contractility in mdx (dystrophic) mice. For this study mdx mice were crossbred with transgenic. TNF[alpha]-deficient mice to generate TNF[alpha]-deficient mdx (TNF[alpha]-/mdx) mice. At 11–12 months of age, ventilation was measured in awake mice during room air breathing and in response to 7% CO2 using the barometric technique. During room air breathing, neither tidal volume, respiratory rate nor minute ventilation (Ve) differed between TNF[alpha]-/mdx and TNF[alpha]+/mdx mice. In response to 7% CO2, TNF[alpha]-/mdx mice significantly increased Ve whereas Ve did not change in the TNF[alpha]+/mdx group (P < 0.05). In vitro isometric contractile properties of the diaphragm were also measured. Maximal isometric force of the diaphragm muscle was significantly higher in the TNF[alpha]-/mdx group when compared to TNF[alpha]+/mdx group (7.57 N/cm2 vs. 5.56 N/cm2, respectively, P < .05). These data suggest that TNF[alpha] plays a role in ventilatory and diaphragm muscle dysfunction in dystrophic mice.

Canadá - um estudo que será publicado na revista Neuromuscular Disorders avaliou em camundongos com distrofia muscular as células satélites, responsáveis pela regeneração muscular. Os pesquisadores observaram que o aumento da enzima óxido nítrico sintetase aumenta a velocidade e a capacidade de regeneração das células satélites. Drogas que aumentem esta atividade podem potenciar o efeito dos corticóides.

Correlated NOS-I µ and myf5 expression by satellite cells in mdx mouse muscle regeneration during NOS manipulation and deflazacort treatment NEW

Judy E. Anderson, Cinthya Vargas
Department of Human Anatomy and Cell Science, Faculty of Medicine, University of Manitoba, 730 William Avenue, Winnipeg, MB, Canada 

Abstract

Satellite cells, muscle precursor cells in skeletal muscle, are normally quiescent and become activated by disease or injury. A lack of dystrophin and changes in the expression or activity of neuronal nitric oxide synthase (NOS-I) affect the timing of activation in vivo. Nitric oxide synthase inhibition delays muscle repair in normal mice, and worsens muscular dystrophy in the mdx mouse, a genetic homologue of Duchenne muscular dystrophy. However, the potential role of activation and repair events mediated by nitric oxide in determining the outcome of steroid or other treatments for muscular dystrophy is not clear. We tested the hypothesis that the extent of repair in dystrophic muscles of mdx mice is partly dependent on NOS-I µ  expression and activity. Myotube formation in regenerating muscle was promoted by deflazacort treatment of mdx dystrophic mice (P<0.05), and improved by combination with the nitric oxide synthase substrate, L-arginine, especially in the diaphragm. NOS-I µ  mRNA expression and activity were present in satellite cells and very new myotubes of regenerating and dystrophic muscle. Deflazacort treatment resulted in increased NOS-I µ  expression in regenerating muscles in a strong and specific correlation with myf5 expression (r=0.95, P<0.01), a marker for muscle repair. Nitric oxide synthase inhibition prevented the deflazacort-induced rise in NOS-I µ and myf5 expression in the diaphragm without affecting the diameter of non-regenerating fibres. These in vivo studies suggest that gains in NOS-I µ  expression and nitric oxide synthase activity in satellite cells can increase the extent and speed of repair, even in the absence of dystrophin in muscle fibres. NOS-I µ may be a useful therapeutic target to augment the effects of steroidal or other treatments of muscular dystrophy.

USA - este estudo foi realizado em laboratório com as células musculares dos camundongos com distrofia muscular. Utilizando oligonucleotídeos de RNA/DNA os pesquisadores conseguiram corrigir a mutação e fazer a célula produzir distrofina com a restauração da funcionalidade da membrana celular. Esta seria uma nova maneira de corrigir o defeito da célula tornando a doença mais amena (transformando a distrofia muscular de Duchenne em Becker).

USA - uma das controvérsias que retardam as pesquisas com células tronco é a utilização das células tronco embrionárias. Pesquisadores da Universidade da Pennsylvania conseguiram transformar células tronco em óvulos. Em se confirmando estas pesquisas em seres humanos os pesquisadores conseguirão uma fonte inesgotável de células tronco para pesquisas.

França - pacientes com distrofia muscular apresentam substituição do músculo por tecido fibroso, inativo para a contração muscular. Nesta pesquisa os cientistas conseguiram demonstrar que o músculo já apresenta alterações da contração antes mesmo do desenvolvimento da fibrose.

USA - de 4 a 8 de junho de 2003 será realizado o Encontro Anual da Sociedade Americana em terapia gênica; neste encontro os maiores pesquisadores em terapia gênica irão apresentar seus trabalhos. Vinte e sete destes trabalhos se referem a pesquisas em terapia gênica na distrofia muscular. Os resumos destes trabalhos em inglês estão aqui. Todos eles demonstram avanços na terapia gênica experimental. Tentarei fazer um resumo das principais pesquisas nos próximos dias. O conteúdo dos primeiros resumos:

1) Sucesso com oligonucleotídeos para terapia gênica

2) Sucesso na correção da distrofia muscular experimental intra-útero

3) Uso da gentamicina na mutação de ponto: descrição de um teste que demonstra os prováveis pacientes que se beneficiarão do tratamento.

4) Sucesso na terapia gênica com vetor viral

5) Sucesso da terapia gênica no músculo diafragma utilizando vetor viral e gel.

6) Terapia gênica com sucesso em um modelo de distrofia tipo cinturas com gene liberado por via intraarterial

7) Uso de terapia gênica utilizando o Igf-1

8) Terapia gênica com um indutor de formação de vasos, o VEGF 165, induzindo  a regeneração dos músculos.

9) Descrição de um novo modelo de distrofia muscular em cães.

10) Sucesso com o uso do mini-gene da distrofina em cães com distrofia muscular

11) Explora o uso do vetor lentiviral em modelos de distrofia experimental; o vetor lentiviral é maior que o AAV e facilita a colocação do gene da distrofina

12) Discute as alterações da células musculares dos vasos dos músculos e a importância da introdução do gene da distrofina também nestas células.

13) Demonstra os resultados positivos do minigene da distrofina em modelos experimentais, com aumento da força muscular.

14) Estuda a relação entre o aumento da utrofina e a redução da calpaína em camundongos que receberam o gene da distrofina; a utrofina pode exercer o mesmo papel da distrofina.

15) Estudo com o uso da corrente elétrica para melhorar a passagem do gene para as células musculares.

16) Obteve maior sobrevida dos mioblastos com a utilização da interleucina 10 por terapia gênica em camundongos.

17)  Apresenta um estudo sobre as diferentes formas de célula tronco.

18) Demonstra que a superexpressão da matrilisina aumenta a migração dos mioblastos e reduz a necessidade de tantas injeções.

19) Estuda maneiras de modificar os mioblastos antes do transplante para evitar rejeição.

20) Analisa as possiblidades de terapia gênica na cardiomiopatia das distrofias.

21) Demonstra os bons resultados da terapia gênica intra-útero (antes do nascimento)

22) Estudo o uso de oligonucleotídeos  na  distrofia miotônica (estuodo in vitro,em laboratório) 

23) Observou que a injeção de células tronco por via intramuscular aumenta a expressão da distrofina e que o transplante de medula óssea não produziu efeito.

24) Estuda a manipulação prévia (em laboratório) das células tronco para terapia gênica

25) Utiliza na terapia gênica vetores com distrofina e proteínas imunossupressoras e obtem a expressão do gene por mais tempo.

26) Demonstra os efeitos do minigene da proteína agrin em camundongos com uma forma de distrofia muscular congênita

27) Estuda a terapia gênica nas células satélites dos músculos responsavéis pela regeneração muscular.

USA - a mutação da disferlina está envolvida em duas formas de distrofia: a tipo cinturas tipo 2b e a de Miyoshi. Neste estudo experimental os pesquisadores identificaram que a ausência de disferlina prejudica a reparação muscular. Esta pesquisa permitirá entender os mecanismos envolvidos nestas duas formas de distrofia e eventualmente entender como esta proteína está atuando nas outras formas de distrofia. Esta notícia foi divulgada em vários sites de notícias:

UI researchers discover new cause of muscular dystrophies

Protein Tied to Muscular Dystrophy, Muscle Repair

Repair defect tied to muscular dystrophy

Suiça - existem várias modalidades de terapia gênica sendo testadas. Neste estudo os pesquisadores tentam fazer a célula passar a produzir distrofina, através da utilização de uma sequência de oligonucleotídeos que copia o DNA, vencendo a mutação. Os resultados desta técnica foram favoráveis.

Canadá - nesta pesquisa os cientistas injetaram em um músculo da perna um vetor viral com o gene da distrofina. Os estudos foram realizados em camundongos recém nascidos e com 4 a 6 semanas de vida. Os resultados demonstraram que no primeiro grupo 42% das fibras expressavam a distrofina após 10 dias e que esta expressão se mantinha por 6 meses após este tratamento. No grupo com maior idade a expressão caia ao longo do tempo. Uma resposta inflamatória foi observada nos camundongos mais velhos. Este é mais um grupo de pesquisa que demonstrou bons resultados experimentais em camundongos.

Japão - utilizando células embrionárias cientistas da Universidade de Kyoto criaram a primeira linhagem de células tronco no Japão. As células forma obtidas de embriões que não iriam ser fertilizados e que seriam descartados. Os pais e portadores brasileiros de distrofia muscular lutam por uma lei que permita a utilização das células tronco de origem embrionária no Brasil.

USA - a PTC, empresa de biotecnologia, tem desenvolvido técnica para terapia gênica utilizando pequenas moléculas para corrigir o defeito genético. Os estudos serão realizados inicialmente em camundongos com distrofia muscular; este tratamento poderá ser utilizado em outras doenças genéticas, metabólicas e no câncer. Em 8 de maio a empresa anunciou o recebimento de nova verba para a realização destes estudos.

Japão - de longa data já se sabe que o cálcio tem um papel no aparecimento da degeneração muscular na distrofia muscular. Neste artigo os autores descrevem um novo fator de crescimento regulador de canal que poderia estar envolvido na entrada de cálcio na fibra muscular. Os estudos como este abrem as portas para pesquisas com drogas que podem retardar a evolução da doença.

USA - neste relato breve o autor descreve o papel da Interleucina 4 na função e atividade dos mioblastos. O autor relata que a utilização desta interleucina pode melhorar os resultados da terapia gênica.

A cytokine that packs a punch 

The Journal of Cell Biology, Volume 161, Number 5, 835-a-835

Muscle cells undergo an unusual developmental program in which several partially differentiated cells called myoblasts fuse to form a multinucleated myotube. This nascent myotube undergoes further maturation and growth, which requires the addition of nuclei by fusion of more mononucleated myoblasts with myotubes. Valerie Horsley, Grace Pavlath, and colleagues (Emory University, Atlanta, Georgia) have found that nascent myotubes promote fusion, and thus their own growth, by secreting a cytokine normally associated with immune cells.The cross-system cytokine is IL-4, which is required in immune cells for macrophage fusion. Not one to throw away a good thing, Nature evidently coopted the system for muscle cells. As in immune cells, IL-4 expression in nascent myotubes is driven by a member of the NFAT transcription factor family. Myotubes lacking either IL-4 or the NFAT factor were smaller and had fewer nuclei than wild-type cells. Recovery from muscle injury was also diminished by the lack of IL-4 or the IL4alfa receptor.Myoblasts are the targets of IL-4 action, which may promote fusion by inducing myoblast expression of adhesion molecules such as integrins (as in macrophages) or VCAM. Alternatively, IL-4 may act as a chemokine, as it does for osteoblasts, to stimulate migration of myoblasts toward myotubes. Whatever the mechanism, stem cell therapies for disorders such as muscular dystrophies may be improved by expression of IL-4 to increase the fusion capacity of the muscle stem cells. 

Alemanha e Canadá -  o sucesso da terapia gênica depende da expressão do gene no músculo pela vida toda. Há ainda muitas dificuldades na busca do agente ideal para este tratamento. Este grupo de pesquisa conseguiu melhorar os resultados da terapia gênica utilizando uma molécula promotora em conjunto com o gene da distrofina. Os resultados foram melhores inclusive em ratos com maior idade. Apesar disto poucos resultados foram observados no coração, no diafragma e em outros músculos. 

Expression of Dystrophin Driven by the 1.35-kb MCK Promoter Ameliorates Muscular Dystrophy in Fast, but Not in Slow Muscles of Transgenic Mdx Mice NEW

MOLECULAR THERAPY Vol. 8, No. 1, July 2003

Patrick Dunant,1 Nancy Larochelle,1,2 Christian Thirion,1 Rolf Stucka,1 Daniel Ursu,3 Basil J. Petrof,4 Eckhard Wolf,1 and Hanns Lochmu¨ller1,*

 E-mail: [email protected]

Successful gene therapy of Duchenne muscular dystrophy may require the lifelong expression of a therapeutic gene in all affected muscles. The most promising gene delivery vehicles, viral vectors, suffer from several limitations, including immunogenicity, loss of therapeutic gene expression, and a limited packaging capacity. Therefore, various efforts were previously undertaken to use small therapeutic genes and to place them under the control of a strong and muscle-specific promoter. Here we report the effects of a minidystrophin (6.3 kb) under the control of a short muscle-specific promoter (MCK 1.35 kb) over most of the lifetime (4–20 months) of a transgenic mouse model. Dystrophin expression remained stable and musclespecific at all ages. The dystrophic phenotype was greatly ameliorated and, most importantly, muscle function in limb muscles was significantly improved not only in young adult but also in aged mice compared to nontransgenic littermates. Dystrophin expression was strong in fasttwitch skeletal muscles such as tibialis anterior and extensor digitorum longus, but weak or absent in heart, diaphragm, and slow-twitch muscles. Additionally, expression was strong in glycolytic but weak in oxidative fibers of fast-twitch muscles. This study may have important implications for the design of future gene therapy trials for muscular dystrophy.

Canadá - células tronco são fontes potenciais de músculos normais. Pesquisadores canadenses identificaram um subtipo de célula tronco (CD45+) com este potencial e utilizando uma proteína denominada Wnt eles conseguiram transformar as células tronco CD45+ em músculos. Eles prosseguem com estes estudos tentando determinar se a aplicação desta proteína  diretamente em animais poderia trazer resultados. Esta notícia esta comentada também nos seguintes artigos:

Ottawa team uncovers how stem cells form muscle

MDA FINDS KEY PROTEIN FOR REBUILDING MUSCLE

Ottawa team discovers 'switch' that tells muscles to repair selves

Japão - este grupo de pesquisadores já tinham descrito previamente uma protease no músculo de camundongos com distrofia muscular denominada de distripsina; esta enzima apresenta atividade intensa antes do aparecimento dos sinais clínicos da doença. Para avaliar o papel desta enzima os autores utilizaram um inibidor desta protease, o mesilato calmostato. Os resultados positivos com esta droga pode abrir uma nova linha de estudo e pesquisa para tratamento medicamentoso da distrofia muscular de Duchenne.

http://www.ananova.com/news/story/sm_797512.html

Inglaterra - neste trabalho divulgado hoje os pesquisadores ingleses utilizando oligonucleotídeos numa técnica conhecida como antisense conseguiram excelentes resultados.  Os oligonucleotídeos foram transferidos em grande porcentagem para a célula com a utilização de um detergente sintético. A força muscular aumentou para 70% do normal por mais de três meses. Apesar do excelente resultado há um grande caminho até a utilização desta técnica em seres humanos. 

Mais links para este artigo:

RESEARCHERS REMOVE GENE DEFECT IN COMMON FORM OF MUSCULAR DYSTROPHY 

Functional amounts of dystrophin produced by skipping the mutated exon in the mdx dystrophic mouse

USA - Pesquisadores tinham com objetivo entender o papel da alteração dos vasos no aparecimento de lesão cardíaca em um modelo em camundongos com deficiência de beta ou delta sarcoglican (distrofia tipo cinturas experimental). Neste estudo eles conseguiram demonstrar que as alterações nos vasos não são responsáveis pelas alterações cardíacas. Além disso eles observaram que a injeção do vetor viral contendo o gene que faltava ao músculo produzia recuperação do músculo cardíaco. Eles concluem que o uso de técnicas de terapia gênica aliadas a medicamentos de proteção do músculo cardíaco pode ser uma estratégia promissora na distrofia tipo cinturas

Novo link: Cell Therapy of {alpha}-Sarcoglycan Null Dystrophic Mice Through Intra-Arterial Delivery of Mesoangioblasts.

Outros links:

Stem Cells Offer Hope for Muscular Dystrophy 

Modified Blood Vessel Stem Cells Might Treat Muscular Dystrophy 

STEM CELLS WORK AGAINST MUSCULAR DYSTROPHY IN MICE,
MDA SCIENTISTS FIND

Itália - estudo realizado em camundongos demonstra o potencial das células tronco retirada de vasos sanguíneos no tratamento da distrofia muscular. Apesar de ser um estudo ainda inicial, eles demonstraram ser possível obter células adultas dos vasos, os mesangioblastos, corrigirem estas células em laboratório e infundí-las novamente em camundongos. O modelo utilizado foi da deficiência do gene da alfa sarcoglican, uma forma de distrofia muscular tipo cinturas. As células tratadas e reinfundidas na circulação ajudaram na produção de células musculares sadias. Como são células retiradas do próprio organismo a possibilidade de rejeição é menor.

Japão - o IGF-1 tem sido testado em distrofia muscular há algum tempo. Neste estudo experimental foram realizadas lesões musculares em camundongos e a o IgF-1 foi transferido ao músculo por corrente elétrica. Os pesquisadores demonstraram que o IGF-1 promove regeneração dos músculos. Este trabalho demonstra o potencial do IGF-1 na regeneração muscular e é uma alternativa para o tratamento da distrofia muscular.

IGF-I gene transfer by electroporation promotes regeneration in a muscle injury model  

Gene Therapy. 10(8):612-620, April 2003.

Takahashi, T 1; Ishida, K 1; Itoh, K 1; Konishi, Y 2; Yagyu, K-I 2; Tominaga, A 2,3; Miyazaki, J-I 4; Yamamoto, H 1

The goal of this study was to determine whether insulin-like growth factor-I (IGF-I) gene delivery by electroporation promotes repair after muscle injury. An injury-repair model was created using mice in which a hamstring muscle was cut and sutured. A total of 50 [mu]g of IGF-I DNA or green fluorescent protein (GFP) DNA (both in pCAGGS) was injected into the lesion and introduced into muscle cells by electrostimulation using an electric pulse generator. The number of regenerating muscle fibers in the IGF-I DNA group was significantly more than that in the GFP DNA group at 2 weeks after injection. The diameter of regenerating muscle fibers from the IGF-I DNA group was larger than that of the GFP DNA group at 4 weeks after injection. There was no significant difference in the serum IGF-I concentration between the IGF-I DNA group and the GFP DNA group at 1, 2, and 4 weeks after injection. However, muscle IGF-I concentration in the IGF-I DNA injection group was significantly greater than that in the GFP DNA injection group at 2 weeks after injection. These results demonstrated that the effects of enhanced IGF-I production were local and limited to the injected area. The ratio (injected/uninjected; intact) of the amplitude of compound muscle action potentials (CMAP) in the IGF-I DNA injection group was greater than that in the GFP DNA injection group at 4 weeks after injection and of the control group. In conclusion, IGF-I gene transfer by electroporation proved to be a simple, safe, inexpensive, and effective method to promote the regeneration of injured muscles in our injury model.  

USA - os músculos dos pacientes com distrofia muscular apresentam aumento do tecido fibroso e a pesquisa de drogas antifibróticas pode permitir descobrir alguma droga útil para retardar a evolução da doença. Neste estudo a droga suramin, que inibe um fator muscular que leva a fibrose foi testada em músculos lesados. Os resultados demonstraram que a droga inibe a formação de fibrose e favorece a regeneração muscular. Esta é mais uma droga que deverá ser estudada experimentalmente na distrofia muscular.

Antifibrotic effects of suramin in injured skeletal muscle after laceration NEW

 J Appl Physiol 95: 771–780, 2003. 

Yi-Sheng Chan,1,2,3 Yong Li,1,2 William Foster,1 Takashi Horaguchi,1,2 George Somogyi,4 Freddie H. Fu,2 and Johnny Huard1,2,5

Muscle injuries are very common in traumatology and sports medicine. Although muscle tissue can regenerate postinjury, the healing process is slow and often incomplete; complete recovery after skeletal muscle injury is hindered by fibrosis. Our studies have shown that decreased fibrosis could improve muscle healing. Suramin has been found to inhibit transforming growth factor (TGF)- beta1 expression by competitively binding to the growth factor receptor. We conducted a series of tests to determine the antifibrotic effects of suramin on muscle laceration injuries. Our results demonstrate that suramin (50 g/ml) can effectively decrease fibroblast proliferation and fibrotic-protein expression (alfa-smooth muscle actin) in vitro. In vivo, direct injection of suramin (2.5 mg) into injured murine muscle resulted in effective inhibition of muscle fibrosis and enhanced muscle regeneration, which led to efficient functional muscle recovery. These results support our hypothesis that prevention of fibrosis could enhance muscle regeneration, thereby facilitating more efficient muscle healing. This study could significantly contribute to the development of strategies to promote efficient muscle healing and functional recovery.

USA - realizado em Ohio, USA, o encontro anual do Parent Project americano reuniu importantes pesquisadores, médicos, fisioterapeutas para relatar aos pais importantes informações sobre a doença e sobre os avanços na terapêutica. No site do Parent Project encontramos os resumos destas apresentações. Após um cadastro as informações podem ser copiadas (textos em inglês). Na medida do possível tentaremos aproveitar este material no site, respeitados os direitos autorais

USA - a médula óssea e o músculo tem uma subpopulação de células denominadas células de superfície. Os autores descrevem uma modalidade de céulas semelhantes na pele. Estas células da pele são semelhantes a dos músculos. Estas células de pele foram isoladas em camundongos, cultivadas em laboratório e transplantadas para camundongos com distrofia muscular. Estas células foram identificadas no músculo e expressavam a distrofina. 

Itália - o uso de mioblastos para terapia gênica esbarra na dificuldade da célula migrar para o músculo. Pesquisadores italianos associados a equipe canadense identificar um subtipo de células tronco de origem muscular com baixa ligação aos vasos sanguíneos; estas células tem maior potencial para utilização em terapia gênica.

China - o estiramento de fibras musculares é reconhecida como causa de lesão muscular na distrofia muscular. Utilizando o gadolinium, o contraste utilizado para a realização da ressonância magnética, os pesquisadores conseguiram reduzir a lesão muscular causada pelo estiramento de fibras musculares de camundongos com distrofia muscular. Este efeito ocorre pela capacidade desta substância bloquear alguns canais da membrana muscular. Portanto seria possível reduzir a lesão muscular com o bloqueio destes canais.

Dinamarca - em trabalhos anteriores a ADAM 12 reduziu as alterações patológicas da distrofia muscular. Há redução da necrose muscular e redução dos níveis de enzima CPK. Neste trabalho os pesquisadores conseguiram aumentar os níveis de utrofina, alfa 7 integrina e outras glicoproteínas em camundongos. Este resultado evidencia que o uso da ADAM 12 é uma alternativa ao uso da distrofina na terapia gênica da distrofia muscular. 

USA - aumento das células inflamatórias é observado em várias doenças musculares como a distrofia. Há um conceito vigente que a presença de células inflamatórias poderia ajudar an reparação do músculo. Neste artigo os autores descrevem os efeitos ruins da presença de células inflamatórias que podem contribuir para a agressão muscular. Há algumas pesquisas estudando modos de bloquear estas células inflamatórias com o objetivo de reduzir a lesão muscular.

USA - a distrofia muscular está associada com inflamação e necrose da fibra muscular no diafragma e pode alterar a respiração. Os pesquisadores estudaram camundongos com distrofia muscular sem fator de necrose tumoral (TNF), uma citocina proinflamatória.  Os animais sem TNF apresentaram melhor função respiratória demonstrando que esta citocina pode exercer um papel na agressão muscular na distrofia muscular. Há drogas que bloqueiam o TNF que serão estudadas em breve na distrofia muscular.

Brasil -  o selênio e a vitamina E são conhecidos antioxidantes e podem atuar prevenindo a apoptose celular (morte celular). Neste artigo os pesquisadores da Universidade Federal de São Paulo utilizaram dieta pobre em selênio e em vitamina E em galinhas e observaram ativação das caspase no músculo, proteína responsável pela morte celular. Não há estudos conclusivos sobre o papel do selênio e da vitamina E na prevenção da lesão muscular das distrofias musculares.

USA - este estudo foi realizado em camundongos submetidos a lesão muscular (não eram camundongos com distrofia muscular). Eles observaram melhora da recuperação dos músculos utilizando terapia combinada com IGF-1, fator que aumenta a regeneração muscular e decorin, droga que bloqueia a fibrose dos músculos. Como a regeneração muscular esta prejudicada na distrofia muscular de Duchenne e a há um aumento da fibrose esta terapia pode ter sucesso nesta doença. A associação de IGF-1 e decorin ainda não foi testada na distrofia muscular experimental.

Austrália -  uma das formas de terapia gênica é tentar corrigir o gene defeituoso com oligonucleotídeos; seria uma forma de terapia gênica mais fácil e poderia ser útil para 70% dos pacientes. Neste estudo eles utilizaram camundongos adultos (o que simula a situação atual desta geração de pacientes com distrofia).  Após a injeção intramuscular dos oligonucleotídeos, 20 a 30% dos músculos expressaram a distrofina. Apesar da expressão ter sido transitória o efeito seria suficiente para melhorar os sintomas (ou seja seria possível transformar uam distrofia de Duchenne numa forma mais branda como a de Becker). Esta é uma pesquisa bastante promissora mais ainda longe de testes em seres humanos.

Enhanced in vivo delivery of antisense oligonucleotides to restore dystrophin expression in adult mdx mouse muscle. 

K.E. Wells;, S. Fletcher, C.J. Mann, S.D. Wilton, D.J. Wells - Australia

FEBS Letters 27592 (2003):1-5

Abstract: The use of antisense oligonucleotides (AOs) to induce  exon skipping leading to generation of an in-frame dystrophin protein product could be of benefit in around 70% of Duchenne muscular dystrophy patients. We describe the use of hyaluronidase enhanced electrotransfer to deliver uncomplexed 2P-O- methyl modified phosphorothioate AO to adult dystrophic mouse muscle, resulting in dystrophin expression in 20-30% of fibres in tibialis anterior muscle after a single injection. Although expression was transient, many of the corrected fibres initially showed levels of dystrophin expression well above the 20% of endogenous previously shown to be necessary for phenotypic correction of the dystrophic phenotype.

Japão - cientistas japoneses estudaram amostras de músculos obtidas em biópsias de pacientes com Duchenne, Becker e distrofia congênita e pesquisaram os fatores de crescimento derivados das plaquetas e seus receptores na distrofia. Diversos fatores derivados das plaquetas estão alterados e podem contribuir para agravar ou tentar regenerar os músculos. Este conhecimento, apesar de ainda ser muito básico irá contribuir para o entendimento das maneiras como o músculo é lesado nas distrofias e como podemos impedir esta lesão com drogas. 

USA - as manifestações cardiacas nas diferentes formas de distrofia muscular são frequentes (mais de 90% na distrofia muscular de Duchenne). Nesta pesquisa foi utilizada uma forma reduzida da distrofina que já tinha demonstrado efeito nos músculos dos membros. O vírus contendo o microgene foi injetado na cavidade do coração. Após 10 meses os resultados demonstrarm um aumento significativo de fibras expressando a distrofina mas o que é mais importante a restauração do complexo proteico da membrana da célula demonstrando  que a integridade da célula tinha sido recuperada. Este trabalho demonstra ser viável o uso da terapia gênica para tratamento das manifestações cardíacas da distrofia muscular.

USA - nesta revisão os autores colocam as dificuldades para a terapia gênica na distrofia muscular e relacionam as alternativas existentes como a estimulação de outros genes para corrigir as consequências da falta da distrofina. Este é um ponto que vários autores tem enfatizado: a necessidade de realizar pesquisas para retardar a evolução da doença até que a terapia gênica seja possível. 

Canadá - este grupo de pesquisa no passado já tinha identificado uma fração de células tronco com capacidade de participar na regeneração muscular. Neste trabalho eles identificam um sinal que as células musculares emitem para que as células tronco participem da regeneração muscular. A identificação deste sinal pode abrir uma nova linha de pesquisas para a descoberta de novos tratamentos.

Australia - o transplante de mioblastos continua sendo pesquisado apesar das céulas transplantadas morrerem rapidamente após o transplante. Neste estudo em camundongos os pesquisadores destruiram o sistema imunológico dos animais com irradiação do corpo todo e um dos grupos de animais recebeu a irradiação somente no local de aplicação dos mioblastos. Os animais irradiados tiveram resultados melhores com o transplante de mioblastos que resultaram em sobrevida de até 80% das células; os resultados foram transitórios mas puderam demonstrar que um dos maiores problemas do transplante de mioblastos é a resposta imune.

OBS: vale lembrar que o Conselho Federal de Medicina proíbe a indicação e a realização de transplantes de mioblastos no Brasil. Estas pesquisas que são realizadas no exterior visam identicar os problemas que levam este tratamento a falhar.  A realização deste procedimento, inclusive com a cobrança de valores exorbitantes é considerado charlatanismo.

USA e Itália - o MG-132 é um inibidor do sistema enzimático de proteínas das células e já foi testado no tratamento do câncer; neste trabalho, utilizando camundongos com distrofia muscular, o MG-132 foi injetado diretamente no músculo e na circulação em doses crescentes. Os autores observaram que os músculos voltaram a expressar a distrofina e outras proteínas da membrana celular. As outras alterações apresentadas nos músculos foram: a) redução da lesão da membrana muscular do músculo diafragma e gastrocnêmio; b) melhora das alterações musculares. Esta droga abre uma nova linha de pesquisa para identificar tratamentos que possam retardar ou parar a evolução da distrofia muscular.

China - pesquisadores chineses construiram um vírus com um minigene humano da distrofina. Este vírus foi injetado em camundongos portadores de distrofia. Os camundongos tratados apresentaram expressão da distrofina com restauração da membrana muscular. Só temos o resumo do artigo que foi publicado em chinês.

Holanda -  neste artigo os autores fazem uma revisão de todas as linhas de pesquisa em distrofia muscular, analisando as probabilidades de sucesso em cada uma delas. Apesar de não trazer novidades o artigo permite entender melhor as formas de terapia gênica atualmente pesquisadas. O artigo está disponível na versão integral em pdf aqui. 

USA - O Encontro Anual da Sociedade de Neurociências será realizado de 8 a 12 de novembro de 2003, em New Orleans. Deste encontro selecionei três artigos relacionados com a distropia muscular: o mais importante é relacionado com a terapia gênica e foi realizado na China. Neste estudo os camundongos com distrofia muscular foram submetidos a transplante de células tronco da medula óssea. Os animais foram submetidos a radioterapia antes do tratamento. Após três meses do tratamento 10% dos animais apresentavam expressão da distrofina. Houve melhora da força muscular nos animais tratados e aumento da sobrevida em relação aos animais do grupo controle. No segundo artigo os autores demonstraram o aumento da expressão do receptor da transferrina em fibras de regeneração em pacientes com distrofia muscular. Este receptor esta relacionado a entrada do ferro e pode indicar um papel deste elemento no retardo da deterioração muscular. O terceiro artigo estuda o efeito dos corticóides na distrofia muscular experimental, tentando entender como esta droga atua.

1) C. Zhang, S. Chen, Y. Xie, W. Huang, S. Li, W. Zhang, Q. Li, X. Liu. THERAPEUTIC EFFECT OF DUCHENNE MUSCULAR DYSTROPHY MICE WITH BONE MARROW STEM CELLS TRANSPLANTATION. Program No. 413.9. 2003

Objective: To investigate the locomotive function, electronic physiology changes, and expression of dystrophin in Duchenne muscular dystrophy mice(mdx and dko) with bone marrow stem cells transplantation.
Methods: The bone marrow stem cells of C57BL/6 4-to-5 weeks age were isolated and cultured in vitro for 3 days, then the stem cells about 5.0X106 injected intravenously into the mdx mice and dko mic 7-to-8 weeks age , respectively. Before injecting, 10 mdx mice and 10 dko mice were preconditioned with 7 Gy gamma ray to decrease the immune reaction. The clinical features of the graft verse host disease (GVHD). in the transplanted mice were assessed and investigated after bone marrow stem cell transplatation..12 weeks after being transplanted, the locomotion function, muscle electrophysiologic features(EMG) and dystrophin expression of the mdx mice and dko mice were investigated..
Results: Three month after bone marrow stem cells transplanting, we find that (1) there were more than 10% of muscle cells expression dystrophin protein in each transplanted mice(mdx and dko); (2) the electromyography showed almost normal waves in the transplantation mdx mice and dko mice; (3)the locomotive function improved obviously in transplantation dko mice; (4)the life span of the transplantation dko mice were more than 200 days( the life span of control of dko mice were less than 140 days).
Conclusions: Allogenic bone marrow stem cells transplantation can improve the electromyographic items, dystrophin expression in muscles of mdx and dko mice. Further more, the stem cell transplantation can improve the locomotive function and prolong the life span of dko mice.

2) Y. Zhu, B. Chen, H. Gong, J. Pan, W. Zhang. EXPRESSION OF TRANSFERRIN RECEPTOR IN DUCHENNE MUSCULAR DYSTROPHY TISSUES. Program No. 80.2. 2003

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is an X-linked, fatal disease caused by mutations of the gene encoding the cytoskeletal protein dystrophin. Skeletal muscle of DMD patients is characterized by an ongoing process of degeneration and regeneration. Transferrin receptor (TfR, CD71), an integral membrane glycoprotein, mediates cellular uptake of iron. In most tissues, TfR expression is correlated positively with proliferation and regulated at the post-transcriptional level. To determine if TfR is involved in muscular regeneration in DMD patients, we examined the expression of TfR in muscle samples of 42 patients with DMD, and 10 from normal volunteers. Immunohistochemical staining of TfR was positive with variable intensity in normal control and DMD patients. In normal control, TfR was faintly expressed on the surface of muscle fibers. In DMD patients, strong TfR reaction was detected. In some muscular fibers from DMD patients, TfR was found strongly expressed inside the fibers. Further detection with Enzyme histochemistry and acridine orange (AO) fluorescence techniques showed that these fibers with strong TfR expression were regenerative IIc type fibers. The increase of TfR expression in regenerative fibers suggests that the high uptake of iron may promote the capacity of muscle regeneration and thus may delay the deterioration of DMD patients.

3) C.G. Carlson. STEADY STATE CALCIUM AND RESTING CALCIUM INFLUX IN NONDYSTROPHIC AND MDX MYOTUBES EXPOSED TO PREDNISONE OR PREDNISOLONE. Program No. 413.10. 2003

Certain glucorticoids, such as prednisone, prednisolone and deflazacort, increase muscle strength and slow the progress of Duchenne muscular dystrophy (Fenichel et al., Neurology, 41, 1874, 1991) by one or more mechanisms that have not yet been fully characterized. Evidence from 45calcium uptake studies in the C2C12 muscle cell line suggests that one mechanism may involve decreases in calcium influx following one or more days of exposure to these agents beginning at the period of myoblast fusion (Passaquin et al., Brit. J. of Pharmacol., 1998). Recent evidence from this laboratory obtained in FURA-loaded cultured lens epithelial cells indicates that some steroids, however, may induce very rapid (seconds to minutes) effects on resting calcium influx measured by the manganese quench technique (Samadi et al., Pfluegers Arch. Europ. J. Physiol.,444, 700-709, 2002). To determine whether glucorticoids exert a unique action on resting calcium influx in dystrophic muscle, studies have begun to characterize any acute, nongenomic effects of prednisone or prednisolone on steady state calcium levels and resting calcium influx in cultured nondystrophic and mdx myotubes. Initial results indicate that neither prednisone (10 microM, 100 microM) nor prednisolone (100 microM) has immediate effects on steady state calcium levels in nondystrophic myotubes, but that prednisolone may induce a slight decrease in manganese quench rate in mdx myotubes at relatively early stages in culture (culture day 12-14). These results further demonstrate the utility of the manganese quench technique in assessing whether short or long term exposure to glucorticoids induces a beneficial reduction in resting calcium influx in dystrophic skeletal muscle.

 

USA - a terapia gênica que tem sido muito testada em cães e camundongos ainda tem sérios problemas a serem resolvidos. Um deles é fazer com que a gene entregue até o músculo continue funcionando em muitas células musculares e definitivamente. Neste experimento que não utilizou o gene da distrofia, eles introduziram no músculo de camundongo um gene da luciferase que faz a céula produzir uma proteína luminosa, fácil de ser identificada. Após algum tempo a célula para de emitir luz, indicando que o gene parou de funcionar. Utilizando em conjunto com o gene da luciferase um outro gene, o da integrase, o músculo continuou a emitir luz prolongadamente, indicando que o gene se integrou à célula. É um trabalho interessante mas ainda muito inicial. Apesar do título da reportagem que fala em cura da distrofia com esta técnica serão precisos muito mais experimentos em camundongos e muitos outros em cães para poder iniciar os testes em humanos. Apesar da notícia estar bem explicada a manchete é muito sensacionalista.

USA - no músculo existem células satélites, precursoras das células musculares com capacidade semelhante a das células tronco; neste estudo em camundongos os pesquisadores utilizaram um vetor viral que levou o minigene da distrofina a estes células precursoras que tiveram o seu defeito genético corrigido. Estas células "tratadas" conseguiram levar o gene da distrofina ao músculo, corrigindo o defeito genético.

USA - neste estudo os pesquisadores corrigiram as células tronco de origem muscular e injetaram em camundongos portadores de distrofia. Houve um resultado positivo desta terapia mas após algumas semanas do experimento houve uma resposta inflamatória no músculo demonstrando mais uma vez que será necesário utilizar um tratamento imunossupressor quando a terapia gênica estiver disponível.

USA -  as calpaínas são enzimas envolvidas na lesão muscular de várias naturezas como na distrofia muscular. Neste estudo cães foram submetidos a dietas com composições proteícas diferentes. Os resultados demonstraram que dietas ricas em proteínas, em cães, tem capacidade de regular a função destas enzimas envolvidas na degeneração muscular.

Espanha - inibir a miostatina é uma maneira de promover aumento da massa muscular. O uso de inibidores da miostatina pode promover aumento muscular na distrofia muscular como foi observado em camundongos. Existe no comércio americano um suplemento alimentar que contém polissacarídeos sulfatados extraídos de uma alga marinha, a Cystoseria canariensis. Este trabalho é o primeiro utilizando este suplemento que demosntrou que estas substâncias realmente ligam-se à miostatina no sangue. Há necessidade de outros estudos que demonstrem que a droga além de se ligar à miostatina também cause a sua inibição.

USA - a entrada de cálcio no músculo com distrofia muscular contribui para o agravamento da lesão muscular. Este é um dos mecanismos de agressão muscular na distrofia. Nesta pesquisa os autores demonstraram que com a terapia gênica em camundongos o fluxo de cálcio no músculo se restabelece, indicando que a terapia gênica pode contribuir para corrigir o defeito genêtico e bloquear um dos mecanismos de agressão dos músculos.

USA - em dezembro, de 13 a 17, será realizado na Califórnia o Encontro Anual da Sociedade Americana de Biologia Celular. Neste encontro serão apresentadas inúmeras pesquisas, das quais eu selecionei as duas que se relacionam com terapia na distrofia muscular. No primeiro artigo os pesquisadores utilizaram a negamicina, um antibiótico da mesma classe da gentamicina para tratamento da mutação de ponto na distrofia muscular de camundongos. Os resultados obtidos com o estudo das células dos camundongos demonstrou que a negamicina tem a mesma capacidade que a gentamicina em corrigir a mutação de ponto e é menos tóxica. No segundo artigo os pesquisadores criaram um camundongo com distrofia muscular e expressava a calcineurina. A calcineurina promoveu aumento da utrofina A, que pode substituir as funções da distrofina. Drogas que aumentem a expressão da calcineurina podem se constituir em uma alternativa para a terapia medicamentosa da distrofia muscular.

Abstracts from 43rd Annual Meeting The American Society for Cell Biology  - California,  13-17 december, 2003 

Negamycin restores dystrophin expression in skeletal and cardiac muscles of mdx mice
M. SHIOZUKA,1 M. ARAKAWA,1 Y. NAKAYAMA,2 T. HARA,2 M. HAMADA,3 D. IKEDA,3 Y. TAKAHASHI,3 R. SAWA,3 Y. NONOMURA,3 K. SHEYKHOLESLAMI,4 K. KONDO,4 K. KAGA,4 S. TAKEDA,5 R. MATSUDA1 ; 1 Dept. of Life Sciences, The University of Tokyo, Tokyo, Japan, 2 Dept. of Tumor Biochemistry, Tokyo Metropolitan Institute of Medical Sciences, Tokyo, Japan, 3 The Institute of Microbial Chemistry, Tokyo, Japan, 4 Dept. of Otolaryngology, The University of Tokyo, Tokyo, Japan, 5 Dept. of Molecular Therapy, National Institute of Neuroscience, Tokyo, Japan

 The ability of aminoglycoside antibiotics to promote read-through of nonsense mutations has attracted interests in these drugs as potential therapeutic agents in genetic diseases. However, strong toxicity of aminoglycoside antibiotics may cause severe side effects during long-term treatment. In this study, we report that negamycin, a dipeptide antibiotic, also restores dystrophin expression in skeletal and cardiac muscles of mdx mouse; an animal model of Duchenne muscular dystrophy (DMD) with a nonsense mutation in dystrophin gene, and in cultured mdx myotubes. Dystrophin expression was confirmed by immunohistochemistry and immunoblotting. We also compared the toxicity of negamycin and gentamicin, and found negamycin to be less toxic. Furthermore, we demonstrated that negamycin bound to a partial sequence decording the eukaryotic rRNA A-site. We conclude that negamycin is a promising new candidate for chemotherapy for DMD and other genetic diseases caused by nonsense mutations.

 Calcineurin-Induced Upregulation of Utrophin Attenuates the Dystrophic Pathology in mdx Mouse Muscle
J. V. Chakkalakal,1 M. Harrison,2 E. R. Chin,3 R. N. Michel,2 B. J. Jasmin1 ; 1 Cellular & Molecular Medicine, University of Ottawa, Ottawa, ON, Canada, 2 Neuromuscular Lab, Laurentian University, Sudbury, ON, Canada, 3 Cardiovascular and Metabolic Diseases, Pfizer Global Research and Development, Groton, CT

 We recently showed that mice expressing a constitutively active form of calcineurin (CnA*) have elevated levels of utrophin A in their muscles (Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 100: 7791-7796, 2003). In the present study, we crossed these transgenic animals with mdx mice to determine whether mdx/CnA* mice would be less affected by the dystrophic process. Since expression of CnA* has been shown previously to stimulate the slow/oxidative myofiber program, we examined the expression of myosin heavy chain isoforms in mdx/CnA* and mdx mice. By immunofluorecence and RT-PCR assays, we observed in mdx/CnA* a shift in myosin heavy chain profile towards a slower, more oxidative phenotype compared to mdx muscles. In addition, we determined that expression of utrophin A and its transcript were increased by ~ 2 fold in mdx/CnA* mouse muscles. Immunodetection of IgM inside myofibers, used in this case as an index of sarcolemmal disruption, showed that the number of IgM-positive fibers was significantly reduced in muscles from mdx/CnA* mice. Consistent with these findings, we also observed that muscles from mdx/CnA* mice showed less variability in fiber size and contained fewer central nuclei. Together, these results demonstrate that enhanced calcineurin activity can have important beneficial effects on the dystrophic phenotype by stimulating the expression of utrophin A. Furthermore, these findings provide specific targets for which pharmacological strategies may be designed to enhance utrophin levels in muscles from patients with Duchenne muscular dystrophy. Funded by the MDA and CIHR.  

Canadá - pesquisadores canadenses demonstraram o potencial das células tronco em regenerar o músculo cardíaco em pacientes que sofreram ataque cardíaco. O aperfeiçoamento desta técnica permitirá o seu uso também em pacientes com distrofia muscular. São pesquisas promissoras, mas ainda iniciais.

USA -  Dois estudos independentes a serem publicados em dezembro de 2003 na revista Nature Medicine confirmam que as células tronco podem regenerar músculos. No primeiro estudo, da Baylor College of Medicine,  as células tronco produzem células inflamatórias que migram para os músculos lesados e se fundem às células musculares. No outro estudo da University of British Columbia do Canadá e da Stanford University School of Medicine encontraram que uma única célula tronco pode reconstituir o sistema hematopoiético e auxiliar a regeneração muscular. Os resultados podem ser úteis no tratamento de pacientes com distrofia muscular mas há necessidade de novos estudos. Os resumos dos artigos podem ser vistos nos links abaixo:

 Single hematopoietic stem cells generate skeletal muscle through myeloid intermediates

Contribution of hematopoietic stem cells to skeletal muscle

Inglaterra - a utrofina A pode substituir a distrofina em pacientes com distrofia muscular. O aumento desta proteína pode compensar a deficiência de distrofina. Neste estudo os autores demonstraram que o aumento da utrofina ocorre independente de haver regeneração no músculo. O objetivo é identificar drogas que possam estimular este aumento da utrofina. O resumo deste artigo que será publicado em breve na revista Neuromuscular Disorders segue abaixo:

A-utrophin up-regulation in mdx skeletal muscle is independent of regeneration NEW

Andrew P. Weir, Jennifer E. Morgan, Kay E. Davies

Abstract

Duchenne muscular dystrophy is a fatal childhood disease caused by mutations that abolish the expression of dystrophin in muscle. Utrophin is a paralogue of dystrophin and can functionally replace it in skeletal muscle. A method to induce utrophin up-regulation in muscle should therefore be therapeutically useful in Duchenne muscular dystrophy. The search for such a method needs to be informed by an understanding of the mechanisms controlling utrophin expression in muscle. Two full length utrophin isoforms are expressed: A and B. A-utrophin is up-regulated in dystrophin deficient skeletal muscle and we sought to test the hypothesis that this up-regulation occurs as a consequence of ongoing regeneration. We measured utrophin expression by immunohistochemistry and immunoblotting in the oesophageal outer muscular layer and in g-irradiated limb muscle from mdx mice. Skeletal muscle in these tissues is dystrophin deficient but not regenerating; we found that A-utrophin up-regulation still occurred. We conclude that utrophin up-regulation in skeletal muscle does not depend on regeneration. An alternative hypothesis involving competition for binding sites between utrophin and dystrophin is discussed. These results have important implications for future studies aiming to effect therapeutic utrophin up-regulation in Duchenne muscular dystrophy patients.

USA - a Napro, empresa de biotecnologia foi escolhida pelo Instituto Nacional de Saúde americano para receber uma verba para realizar pesquisas em camundongos e cachorros para corrigir a distrofia muscular através de técnicas de terapia gênica.

USA - este grupo de pesquisadores envolvidos em algumas linhas de pesquisa em distrofia muscular (como o da inibição da proteína miostatina) faz uma revisão sobre os atuais conhecimentos da doença e seu tratamento e as linhas de pesquisa que estarão sendo pesquisas no futuro próximo. 

Holanda - há cerca de uma semana informamos que um pesquisador japonês iniciou uma forma de terapia gênica em pacientes com distrofia muscular de Duchenne. A limitação desta técnica é que ela só é útil para portadores de deleção do exon 20 e 20+. Neste trabalho em laboratório, utilizando células de pacientes com distrofia muscular os pesquisadores realizaram  um aperfeiçoamento desta técnica de oligonucleotídeos que pode permitir o tratamento independente do local da deleção. 

Canadá - este artigo já foi apresentado em Congresso e divulgado no site em novembro. Em artigos anteriores os pesquisadores já tinham demonstrado que o aumento da atividade da calcineurina aumenta os níveis de utrofina. Neste artigo eles demonstram que o aumento da atividade da calcineurina reduz as alterações patológicas dos músculos de camundongos com distrofia muscular. Eles abrem um caminho para o estudo de novas drogas para retardar a evolução da distrofia muscular.

Nova Zelândia - pesquisadores associados a uma empresa de biotecnologia neozelandesa, a Ovita, estão estudando a inibição da miostatina como forma de aumentar a massa muscular. Eles observaram em estudos experimentais que a miostatina inibe as células satélites musculares, responsáveis pela regeneração dos músculos. Há várias formas de tratamento sendo estudadas com a inibição desta proteína e este é também um campo promissor para pesquisas em distrofia muscular.

Japão - este artigo já foi apresentado em Congresso e já tinha sido relatado anteriormente no site. Os antibióticos aminoglicosídeos tem demonstrado experimentalmente a capacidade de restaurar a produção de distrofina em animais com mutação de ponto ou em laboratório em células de pacientes com mutação de ponto. Este grupo estudou a negamicina, um antibiótico do mesmo grupo mas com menor toxicidade. Os resultados demonstraram que a negamicina tem a capacidade de restaurar a produção de distrofina, de modo semelhante a gentamicina.

Cingapura - estudando o peixe zebra cientistas de Cingapura identificaram o chamado u-boot gene que pode estar envolvido com a diferenciação de células musculares em rápidas ou lentas durante o período embrionário. Esta identificação poderá ser importante no estudo dos mecanismos genéticos envolvidos com as miopatias congênitas.

Bélgica - a creatina é um dos suplementos utilizados e testados em várias formas de distrofia muscular. Nesta pesquisa a creatina foi adicionada ao meio de cultura de células. Após 72 horas houve um significativo aumento do IGF-1 e dos fatores reguladores miogênicos. Este resultado demonstra que a hipertrofia observada com o uso da creatina pode se dever em parte a estes fatores.

IN PRESS  (FEBS Letters: 28018 (2004) 1-5) - Creatine increases IGF-I and myogenic regulatory factor mRNA in C2C12 cells NEW

Magali Louis, Ronald Van Beneden, Mischael  Dehoux, Jean Paul Thissen, Marc Francaux;

Abstract: Addition of creatine to the diferentiation medium of  C2C12 cells leads to hypertrophy of the myotubes. To investigate  the implication of insulin-like growth factor I (IGF-I) and myogenic regulatory factors (MRFs) in this hypertrophy, their  mRNA levels were assessed during the first 72 h of diferentiation. Creatine significantly increased the IGF-I mRNA level over the whole investigated period of time, whereas the MRF mRNA levels were only augmented at precise moments, suggesting a general activation mechanism for IGF-I and a specifically regulated mechanism for MRF transcription. Our results suggest therefore that creatine-induced hypertrophy of C2C12 cells is at least partially mediated by overexpression of IGF-I and MRFs.

Rússia -  nesta semana tivemos acesso a 3 resumos (copiados abaixo) de artigos publicados na Rússia a cerca da distrofia muscular. No primeiro os pesquisadores estudaram células musculares com mutação de ponto (uma forma de mutação que atinge 10 a 15% dos portadores de distrofia muscular de Duchenne) e observaram que a supressão do gene tRNA pode promover a produção de distrofina. Estudando esta técnica em camundongos com distrofia eles observaram um resultado positivo em 2,5% das fibras. É um resultado muito discreto mas esta técnica precisa ser melhor estudada. No segundo artigo eles fazem uma revisão das técnicas de terapia gênica que estão sendo estudadas na Rússia. No terceiro artigo os pesquisadores relatam a técnica de transplante de mioblastos no músculo da perna de 4 pacientes com distrofia muscular de Duchenne; em três ele constatou a presença de distrofina; neste terceiro artigo não existem informações sobre a técnica utilizada e se os pacientes fizeram uso de imunossupressores.

13/01/04: Suppression of Nonsense Mutations in the Dystrophin Gene by a Suppressor tRNA Gene NEW 

Kiselev, A. V.; Ostapenko, O. V.; Rogozhkina, E. V.; Kholod, N. S. ; Seit-nebi, A. S. ; Baranov, A. N.; Lesina, E. A.; Ivashchenko, T. E.; Sabetskii, V. A.; Shavlovskii, M. M. ; Rechinsky, V. O. ; Kisselev, L. L. ; Baranov, V. S. - from Russia

Molecular Biology. 36(1):30-33, January/February 2002

Nonsense mutations in the dystrophin gene are the cause of Duchenne muscular dystrophy (DMD) in 10-15% of patients. In such an event, one approach to gene therapy for DMD is the use of suppressor tRNAs to overcome the premature termination of translation of the mutant mRNA. We have carried out cotransfection of the HeLa cell culture with constructs containing a suptRNA gene (pcDNA3suptRNA) and a marker LacZ gene (pNTLacZhis) using their polymer VSST-525 complexes. It was found that the number of cells producing [beta]-galactosidase depends inversely on the dose of the suptRNA gene. A single in vivo injection of the construct providing for expression of the suptRNAochre gene into mdx mouse muscle resulted in the production of dystrophin in 2.5% of fibers. This suggests that suppressor tRNAs are applicable in gene therapy for hereditary diseases caused by nonsense mutations

13/01/04: The Current State and Prospects of the Gene Therapy of Duchenne Muscular Dystrophy Worldwide and in Russia NEW 

Baranov, V. S. ; Baranov, A. N. ; Zelenin, A. V. from Russia

Russian Journal of Genetics. 37(8):868-875, August 2001

Failure of drug therapy of Duchenne muscular dystrophy (DMD) stimulated intense search for adequate methods of gene therapy (GT) which would ensure effective delivery of the dystrophin (D) gene, its long-term persistence in transfected cells, and its expression in muscle fibers. The main results of the experimental GT of DMD with the use of viral and nonviral delivery of the D gene into muscles of biological models are discussed. Delivery of a mini-gene of D with a specific muscle promoter using a modified adenoassociated virus is currently the most promising method, which will soon be available for clinical trials. The main results of the studies on the DMD GT in Russia are summarized. The results of experiments on genetic transfection of mdx mice with marker genes and various constructions with the D gene are outlined. The genes are delivered into muscles by means of gene gun, electroporation, viral oligopeptides, liposomes, microspheres, lactoferine, and other nonviral vehicles. It is emphasized that consolidation of funds and efforts of all Russian laboratories dealing with gene and cell therapy of DMD are necessary to complete the experiments and start clinical trials.

13/01/04: Expression of Dystrophin in Duchenne Muscular Dystrophy Patients after Myoblast Transplantation NEW 

Shishkin, S. S.; Terekhov, S. M.; Krokhina, T. B.; Shakhovskaya, N. I.; Podobedova, A. N.; Lyannaya, G. F. ; Tarasov, V. I.; Ovchinnikov, V. I.; Krakhmaleva, I. N.; Zakharov, S. F.; Ershova, E. S.; Limborska, S. A.; Pogoda, T. V.; Zotikov, E. A.; Kut'ina, P. M.; Tarksh, M. A.; Sukhorukov, V. S.; Gerasimova, N. L.  from Russia

Based on originally designed technique of myoblast cultivation and in accordance with the approved by the Russian Ministry of Health "one muscle treatment" protocol of myoblast transplantation to the Duchenne muscular dystrophy patients, the first in Russia clinical trial of this gene correction method was carried out. Immunologically related myoblast cultures (30 to 90 million cells per patient) were injected after all preliminary procedures into tibialis anterior muscles of four boys selected from a group of volunteer recipients (Duchenne muscular dystrophy patients) based on the analysis of a number of surface antigens in donor-recipient pairs. The condition of the patients remained satisfactory during the whole period of post-transplantation follow-up (from 6 months to 1.5 years). Six months after myoblast transplantation the presence of donor DNA or dystrophin synthesis was demonstrated in muscle biopsies of three out of four patients. This result confirms efficacy and safety of the procedure used. 

Austrália - a regeneração muscular é uma forma de retardar a evolução da distrofia muscular. Pesquisadores estão identificando formas de aumentar a regeneração muscular. Neste estudo os pesquisadores demonstraram o papel da calcineurina nesta regeneração. É um caminho a ser estudado para retardar a evolução da doença.

França - a gentamicina, um antibiótico aminoglicosídeo,  tem sido testada em várias doenças genéticas que apresentam mutação de ponto (distrofia muscular, fibrose cística, hemofilia); em seres humanos os resultados ainda são contraditórios. Neste estudo em camundongos os pesquisadores avaliaram as alterações vasculares decorrentes da ausência de distrofina. As alterações decorrentes da ausência de distrofina foram totalmente revertidas pela gentamicina. Estes resultados esclarecem algumas alterações dos vasos vistas na distrofia e abre perspectivas para a correção destes defeitos com o uso de drogas.

Itália - a HMGB1 é uma proteína extracelular liberada em tecidos inflamados ou necróticos;  pesquisadores italianos demonstraram que esta proteína é capaz de atrair mesangioblastos para o musculo de camundongos com distrofia e ajudar na regeneração muscular.

USA - o IGF-1 tem sido pesquisado em distrofia muscular. Neste estudo em camundongos normais com treinamento físico os pesquisadores demonstraram a hipertrofia dos músculos. O uso de IGF-1, ainda não disponível, poderá ser uma alternativa para tratamento medicamentoso da distrofia muscular.

Itália - embriões tem capacidades regenerativas que são perdidas na vida extra-uterina; pesquisadores italianos criaram camundongo capaz de manter esta capacidade; eles já sabiam que as células tronco são capazes de migrar por longas distâncias para corrigir tecidos lesados. Eles descobriram uma forma de IGF-1 muscular (mIGF-1) que emite sinais para atrair as células tronco.  Ela funcionaria como um megafone para avisar as células tronco. Eles criaram em laboratório um camundongo capaz de produzir muitas mIGF-1 e com células tronco de medula fosforescentes. Estes camundongos passaram a apresentar uma alta capacidade de regeneração muscular. Com a ajuda do mIGF-1 foi possível atrair as células tronco que se diferenciaram em células do músculo. A próxima etapa é descobrir como fazer o organismo aumentar a produção de mIGF-1. O artigo integral pode ser lido aqui.

Coréia - cientistas coreanos conseguiram extrair células tronco de embriões clonados em laboratório. Este procedimento que não tem relação com a clonagem reprodutiva abre caminho para obtenção de células pluripotentes, capazes de se transformar em qualquer tipo de célula ou tecido.  Você pode ler mais sobre o tema neste artigo:

Koreans succeed in stem cell first

A Dra. Mayana Zatz escreveu um artigo para a Folha de São Paulo de ontem (13/02/04) esclarecendo o tema. A preocupação no momento relaciona-se com a futura decisão do Senado que irá modificar a lei da Biosegurança, já votada na Câmara dos Deputados e que proibe qualquer forma de clonagem; se esta decisão não for modificada o Brasil  impedirá as pesquisas e a possibilidade de utilização de células tronco no Brasil. Precisamos pressionar os senadores. A cópia do texto é a seguinte:

Esperança renovada

MAYANA ZATZ
ESPECIAL PARA A FOLHA

A pesquisa que acaba de ser publicada na revista "Science" por um grupo de cientistas coreanos (Hwang e colegas, 2004) confirma a possibilidade de obter células-tronco pluripotentes (capazes de se diferenciar em vários tecidos) a partir da técnica de clonagem terapêutica ou transferência de núcleos (TN). Trata-se de uma nova esperança de obtenção de células-tronco para fins terapêuticos, e poderá no futuro representar a esperança de cura para milhares de afetados por doenças neurodegenerativas, muitas delas letais antes da segunda década de vida.
Essa pesquisa está sendo publicada num momento extremamente importante no Brasil, em que se discute um projeto de lei sobre biossegurança que veta pesquisas com embriões. O projeto que acaba de ser aprovado pela Câmara dos Deputados mostra uma confusão entre três conceitos: a) clonagem reprodutiva; b) clonagem terapêutica; e c) terapia celular com células-tronco (que não é sinônimo de clonagem terapêutica).
Antes da votação do texto definitivo no Senado Federal, é fundamental que os parlamentares entendam que a terapia celular com células-tronco, incluindo as embrionárias, podem representar a esperança de tratamento para milhões de brasileiros afetados por doenças genéticas (que atingem mais de 5 milhões de pessoas, a maioria crianças e jovens), que sofrem de doenças comuns como o diabetes e a doença de Parkinson, ou que estão incapacitados porque sofreram acidentes.
A clonagem reprodutiva humana, que seria a tentativa de produzir uma cópia de um indivíduo, é condenada por todos. Deve realmente ser proibida.
A clonagem terapêutica ou transferência de núcleo nada mais é do que um aprimoramento das técnicas hoje existentes para culturas de tecidos, que são realizadas há décadas. A vantagem é que, ao transferir o núcleo de uma célula de uma pessoa para um óvulo sem núcleo, esse novo óvulo, ao se dividir, gera células potencialmente capazes de produzir qualquer tecido em laboratório.
Isso abre perspectivas fantásticas para futuros tratamentos. Seria o caso de reconstituir a medula de alguém que se tornou paraplégico após um acidente, ou de substituir o tecido cardíaco em uma pessoa que sofreu um infarto. Entretanto, no caso de portadores de doenças genéticas, não seria possível usar as células da própria pessoa (porque todas têm o mesmo defeito genético).
Existem células-tronco em vários tecidos (como medula óssea, sangue e fígado) de crianças e adultos. Entretanto, a quantidade é pequena, e não sabemos ainda em que tecidos elas são capazes de se diferenciar. A maior limitação dessa técnica, o autotransplante, que tem mostrado resultados promissores em pessoas com insuficiência cardíaca, é que ela também não serviria para portadores de doenças genéticas.
O sangue do cordão umbilical e da placenta é rico em células-tronco, mas não sabemos ainda qual é seu potencial de diferenciação. Se as pesquisas mostrarem que células-tronco de cordão umbilical serão capazes de regenerar tecidos ou órgãos, serão sem dúvida a fonte mais importante.
Teríamos de resolver então o problema de compatibilidade entre as células-tronco do cordão doador e o receptor. Para isso será necessário criar, com a maior urgência, bancos de cordão públicos. Quanto maior o número de cordões em um banco, maior a chance de achar um compatível.
Se as células-tronco de cordão não derem os resultados esperados, a alternativa será o uso de células-tronco embrionárias. Elas podem ser obtidas pela técnica de transferência de núcleo, como na pesquisa sul-coreana, ou a partir de embriões que são descartados em clínicas de fertilização.
É justo deixar morrer uma criança ou um jovem afetado por uma doença neuromuscular letal para preservar um embrião cujo destino é o lixo? Um embrião que, mesmo implantado em um útero, teria um potencial baixíssimo de gerar um indivíduo?
Ao usar células-tronco embrionárias para regenerar tecidos em uma pessoa condenada por uma doença letal, não estamos na realidade criando vida? Isso não é comparável ao que se faz hoje em transplantes, quando se retiram os órgãos de uma pessoa com morte cerebral, mas que poderia permanecer em vida vegetativa?
A maioria dos países da União Européia, o Canadá, a Austrália, o Japão e Israel aprovaram pesquisas para obtenção de células-tronco embrionárias obtidas por clonagem terapêutica ou de embriões com até 14 dias. Essa é também a posição das academias de ciência de 63 países, inclusive a brasileira.
Muitos acreditam que a vida começa no momento da fertilização. Entretanto, cientistas da Coréia acabam de demonstrar que células-tronco pluripotentes podem ser obtidas sem fertilização. É fundamental que a nossa legislação também aprove essas pesquisas, porque elas poderão no futuro salvar inúmeras vidas.
 

Mayana Zatz é professora-titular de Genética Humana e Médica no Instituto de Biociências da USP, coordenadora do Centro de Estudos do Genoma Humano/IB-USP, presidente da Associação Brasileira de Distrofia Muscular e membro da Academia Brasileira de Ciências
 

Canadá - este grupo de pesquisadores avaliou os resultados tardios obtidos com a terapia gênica em camundongos com distrofia muscular.  Após um ano do tratamento os camundongos apresentaram ainda expressão da distrofina e aumento da força muscular. Os camundongos desenvolveram reação imunológica a proteína distrofina que não impediu a melhora das alterações musculares.

USA - para que o resultado da terapia gênica seja eficiente há necessidade de que pelo menos 20% das células expressem o gene administrado. A entrega do gene ao músculo é uma das maiores dificuldades para a eficiência da terapia gênica. Utilizando um processo mal explicado (dito semisintético) eles injetaram um trecho do DNA contento o gene da distrofina na veia ou artéria de camundongos portadores de distrofia. Com esta técnica eles observaram que a distrofina se expressou nos músculos de ambas as pernas após este tratamento, demonstrando que este é um método promissor de entrega do gene ao músculo.

Inglaterra -  um dos problemas da terapia gênica é a resposta que os músculos tem à expressão da distrofina, que é considerada estranha ao músculo. No modelo experimental os pesquisadores conseguiram fazer o músculo expressar a distrofina humana prolongadamente sem grande resposta inflamatória.

Austrália - beta dois agonistas são drogas utilizadas no tratamento da asma. Algusn grupos utilizam estas drogas para aumentar a força muscular e em breve divulgaremos o resultado da pesquisa com estas drogas na distrofia muscular de Duchenne. Neste estudo os pesquisadores usaram o fenoterol, uma droga beta agonista em ratos velhos e observaram aumentam da força muscular. Este é um grupo de drogas que tem potencial de uso em várias formas de distrofia. 

USA - recentemente células precursoras foram identificadas nos músculos com um potencial que se assemelha as células tronco. Neste estudo, liderado por Louis M Kunkel, descobridor do gene da distrofina, as células precursoras musculares de camundongos com distrofia foram retiradas do músculo e receberam o microgene da distrofina. O microgene foi introduzido na células por um vetor viral. Este microgene consegue fazer a célula produzir distrofina. Estas células precursoras tratadas foram injetadas em  veias dos mesmos camundongos e migraram para os músculos doentes. Esta é uma boa alternativa para a terapia gênica por utilizar as células precursoras do animal doente, diminuindo a change de rejeição às células e a resposta inflamatória do músculo.

USA - recentemente eu tenho incluído vários artigos sobre o uso da gentamicina em distrofia muscular e em outras doenças genéticas. Este trabalho foi realizado por um grupo que há muito tempo tem estudado o uso desta droga.  Neste estudo além da gentamicina eles estudaram outras drogas do mesmo grupo com a amicacina, tobramicina etc. Os autores obervaram uma resposta bastante variada, dependendo da localização da mutação de ponto. Este é um grupo de drogas que precisa ser melhor estudado, inclusive para determinar quem poderia ser beneficiado por este tratamento.

USA - este congresso será realizado em São Francisco a partir de 24 de abril de 2004 e é considerado um dos maiores encontros de neurologistas do mundo. No entanto o número de artigos falando sobre distrofia é muito baixo, muito inferior ao de outras doenças como a esclerose múltipla e a doença de Parkinson. Além disso poucos destes resumos abordam aspectos da terapia da doença. A maioria descreve algumas formas de distrofia, características genéticas, etc. Isto demonstra um desinteresse por este grupo de doentes, em especial com relação aos aspectos importantes da doença como tratamento medicamentoso, fisioterapia, cirurgia, etc. Os resumos que falam sobre distrofia (todas as formas) podem ser lidos em inglês aqui.

Itália -  a eritropoetina é um hormônio que regula a produção de glóbulos vermelhos. Experiências clínicas e experimentais sugerem que a eritropoetina tem um efeito positivo na musculatura esquelética e cardíaca.  Eritropotina pode estimular as células satélites musculares e os mioblastos, além de estimular a angiogênese e pode aumentar o suprimento de oxigênio do músculo. Em humanos tem sido observado efeito positivo em atletas que fazem uso ilegal da substância (é considerado doping). Apesar das evidências favoráveis ao uso da eritropoetina não há estudos experimentais e nem clínicos na distrofia muscular.

IN PRESS (Medical Hypotheses, 2004): Erythropoietin: a new tool for muscle disorders? 

C. Scoppetta, F. Grassi (E-mail address: [email protected] (C. Scoppetta).) 

Summary The main action of erythropoietin (EPO) is to regulate the production of red cells. However both experimental evidence and clinical experience suggest that erythropoietin has a positive effect on skeletal and cardiac muscle. Mice lacking EPO or its receptors suffer from hearth hypoplasia and have a reduced number of proliferating cardiac myocytes. EPO receptors are expressed on mouse primary satellite cells and in cultured myoblasts, and their stimulation appears to enhance proliferation and reduce the differentiation of both cell types. Moreover EPO is capable of promoting angiogenesis in muscle cells, which provides an additional route to increase oxygen supply to active muscles. In men, the effects of EPO on muscle cells are suggested by the illegal use of EPO by agonistic and amateur athletes to enhance their performances. In some athletes EPO improved their long-duration muscular performances much more than expected on the basis of the increment of the blood hemoglobin alone. Our proposal is to investigate the effect of EPO treatment in various animal models of muscular dystrophies (MD), which are common hereditary primary muscle disorders characterized by muscle damage and wasting, to date without any effective treatment. The ability of EPO to induce the proliferation of satellite cells in the presence of differentiating conditions, typical of the damaged muscle, may represent a tool to expand the cellular population competent for muscle repair. This would lengthen the period when muscles can be efficiently repaired. In the presence of positive results, the possibility could be considered of selecting some of the human forms of MD and treating the patients with EPO.

Austrália - a destruição dos músculos na distrofia muscular envolve inúmeros fatores como o fator de necrose tumoral (TNF). Em camundongos com distrofia muscular o uso de uma droga que bloqueia o TNF, o remicade, promove retardo na deterioração do músculo, sem efeitos colaterais sobre os músculos em formação. Esta é uma importante linha de pesquisa que deve ser melhor estudada, inclusive com relação ao efeito sobre a força muscular

USA - usando um modelo experimental da doença de Pompe, camundongos foram submetidos a terapia gênica no músculo diafragma. Para levar o gene ao músculo os pesquisadores utilizaram um gel comum. Os animais tratados apresentaram recuperação da função respiratória com este tratamento; esta tecnica pode ser testada em outros modelos e em outras formas de distrofia.

Europa - reunião de 18 especialistas em biologia molecular abordou aspectos de uma forma de estratégia para as distrofias musculares: a indução de hipertrofia muscular. Assim como no envelhecimento acredita-se que na distrofia muscular ocorre progressiva destruição muscular e redução da capacidade regenerativa. Estratégias que causem aumento da massa muscular podem melhorar os sintomas da doença; a superexpressão do Igf-1 ou o bloqueio da miostatina podem contribuir para melhorar a força muscular. No artigo os autores discutem os resultados das pesquisas experimentais nesta área.

17/04/04: IN PRESS (Neuromuscular Disorders, 2004) Inducing muscle hypertrophy as a therapeutic strategy for muscular dystrophies. 122nd ENMC International Workshop, Naarden, The Netherlands, 28–30 November 2003 NEW

Ketan Patel, Francesco Muntoni - London

Patients with a variety of neuromuscular disorders and most noticeably with muscular dystrophies experience profound muscle wasting. In muscular dystrophies this is believed to be the result of increased muscle damage and progressive loss of regeneration capacity by the satellite cells. Muscle wasting is also a process that occurs during ageing. Recent studies suggest that the muscle atrophy observed both in aged and dystrophic muscle can be effectively counteracted by strategies aimed at inducing an increase in muscle mass. To this end animal models have been developed such as those conditionally over expressing insulin-like growth factor 1 (IGF-1) in skeletal muscle, which resulted in sustained hypertrophy. This not only preserved the muscle mass in ageing skeletal muscle, but also improved the function of dystrophic muscle in the mdx mouse, the animal model for Duchenne muscular dystrophy. Interference with myostatin function by transgenic approach or using blocking antibodies, has resulted in functional improvement of the dystrophic histological and clinical phenotype in mdx mice. These approaches suggest that interfering with the programme of skeletal muscle regeneration and growth can lead to potential benefit in patients with muscular dystrophies and, potentially, other neuromuscular disorders and possibly the entire ageing population. We recently convened a European Neuromuscular Centre Workshop in which 18 participants from five countries (France, Germany, Italy, UK and USA) working on cellular and molecular aspects discussed the topic of ‘inducing muscle hypertrophy as a therapeutic strategy for muscular dystrophies’.

França - existe um modelo animal que utiliza um verme, Caenorhabditis elegans, sem o gene da distrofina. É um modelo de estudo barato e rápido para avaliar os resultados, sendo que este verme não apresenta inflamação. O uso de corticóides contribuiu para reduzir a degeneração das fibras musculares em 40%, provavelmente por ação direta no músculo. O artigo está em vias de publicação na Revista Neuromuscular Disorders e o resumo em inglês esta a seguir:

Prednisone reduces muscle degeneration in  dystrophin-deficient Caenorhabditis elegans 

Aurélie Gaud, Jean-Marc Simon, Thomas Witzel, Maité Carre-Pierrat, Camille G. Wermuth, Laurent Ségalat - France

Abstract

Duchenne muscular dystrophy is a degenerative muscular disease caused by mutations in the dystrophin gene. There is no curative treatment against Duchenne muscular dystrophy. In several countries, the steroid prednisone (or analogs) is prescribed as a palliative treatment. In the model animal Caenorhabditis elegans, mutations of the dys-1 dystrophin-like gene lead to a muscular degenerative phenotype when they are associated with a mild MyoD mutation. This cheap and fast-growing model of dystrophinopathy may be used to screen for molecules able to slow muscle degeneration. In a blind screen of approximately 100 compounds covering a wide spectrum of targets, we found that prednisone is beneficial to the C. elegans dystrophin-deficient muscles. Prednisone reduces by 40% the number of degenerating cells in this animal. This result is a proof-of-principle for the use of C. elegans as a tool in the search for molecules active against the effects of dystrophin-deficiency. Moreover, since C. elegans is not susceptible to inflammation, this suggests that prednisone exerts a direct effect on muscle survival.

Japão - neste estudo realizado em animais e em biópsias de pacientes com distrofia muscular de Duchenne os pesquisadores identificaram uma enzima que está aumentada em áreas de regeneração muscular. Nas biópsias de pacientes com distrofia muscular está enzima está reduzida, indicando que a sua redução pode estar envolvida na progressão da doença.

USA - este é o congresso mundial  mais importante na área de doenças pulmonares. Neste ano o congresso ocorrerá em Orlando, em maio e lá serão apresentados 8 trabalhos relacionados à distrofia. Um dos artigos (o número 1) fala dos resultados positivos com terapia genética para o músculo diafragma de camundongos com distrofia. O artigo sete fala de uma nova forma de ventilação mecânica em pacientes com distrofia muscular.  O número 8 descreve os efeitos da associação entre corticóides e creatina em ratos normais. Os resumos em inglês podem ser lidos aqui. Encontrei também no site do congresso 22 artigos apresentados nos últimos anos (2001-2003) nestes encontros. Há importantes artigos falando na melhora da função pulmonar com o uso dos corticóides, nos benefícios da ventilação não invasiva (que já é usada no exterior há 10 anos), alterações do sono na distrofia, equipamentos de estimulação da tosse, experimentos com terapia gênica em animais entre outros. Os resumos em inglês podem ser lidos aqui.

França - o controle da entrada do cálcio e sua liberação na célula é um dos pontos aceitos como responsáveis pela lesão dos músculos na distrofia muscular. Neste artigo, escrito pelo grupo francês que realizou as primeiras pesquisas em terapia gênica em pacientes, os autores estudaram em laboratório células de pacientes com distrofia muscular que foram submetidas a terapia gênica com mini gene ou gene inteiro da distrofina. O tratamento resultou em melhor controle do cálcio das células musculares. Isto indica que a distrofina tem um papel importante neste controle e que a terapia gênica pode restaurar este controle e diminuir a lesão muscular. Este artigo que será publicado na Revista Experimental Cell Research este ano tem o seguinte resumo em inglês:

Improvement of calcium handling and changes in calcium-release properties after mini- or full-length dystrophin forced expression in cultured skeletal myotubes NEW

Eric Marchand, Bruno Constantin, Haouaria Balghi, Marie-Christine Claudepierre, Anne Cantereau, Christophe Magaud, Aklesso Mouzou, Guy Raymond, Serge Braun, and Christian Cognard - FRANCE

Abstract

Dystrophin is a cytoskeletal protein normally expressed underneath the sarcolemma of muscle fibers. The lack of dystrophin in Duchenne muscular Dystrophy (DMD) muscles results in fiber necrosis, which was proposed to be mediated by chronic calcium mishandling. The extensive comparison of dystrophic cells from human or mdx mice with normal muscles have suggested that the lack of dystrophin may alter the resting calcium permeability and steady-state levels of calcium, but this latter observation remains controversial. It is also not clear, whether calcium mishandling is resulting from the dystrophic process or if dystrophin can directly regulate calcium handling in muscle cells.This prompted us to determine if transfection of full-length dystrophin or Becker Muscular Dystrophy (BMD) minidystrophin, a candidate for viral-mediated gene therapy, could change calcium handling properties. We took advantage of specific properties of Sol8 cell line showing the absence of dystrophin expression together with a drastic calcium mishandling. Here, we show that full-length dystrophin allowed the recovery of a low resting intracellular-free calcium concentration together with lower calcium transients. We also show for the first time that stable expression of minidystrophin was able to restore normal calcium handling in Sol8 myotubes through a better control of steady-state levels, calcium transients, and subcellular calcium events. It suggests that dystrophin could play a regulatory role on calcium homeostasis apparatus and that functional links exist between calcium signaling and cytoskeleton.

USA - a utrofina é uma proteína celular que pode exercer algumas funções da distrofina e melhorar os sintomas da distrofia. Neste estudo utilzando células musculares em laboratório os pesquisadores conseguiram aumentar a produção de utrofina com a adminstração de ácido okadaico. Aumento da utrofina é uma maneira interessante de melhorar os sintomas da distrofia e está é mais uma maneira que precisa ser melhor estudada. O artigo que brevemente será publicado na Revista Neuroscience Letters tem o seguinte resumo:

IN PRESS (Neuroscience Letters, 2004) Okadaic acid augments utrophin in myogenic cells 

Marianna Rodova, Kyle Brownback, Michael J. Werle - USA

Abstract

Duchenne muscular dystrophy is a fatal childhood disease caused by mutations that abolish the expression of dystrophin in muscle. Utrophin is a paralogue of dystrophin and can functionally replace it in skeletal muscle. A potential therapeutic approach is to increase utrophin levels in muscle. One way to achieve this aim is to increase the expression of the utrophin gene at a transcriptional level via promoter activation. In this study, we have shown that utrophin A mRNA levels can be induced by okadaic acid in murine myogenic C2C12 cells. We have found that a utrophin A promoter reporter can be induced by Sp1 in C2C12 myoblasts, but not in myotubes. This activation can be enhanced by okadaic acid treatment. Our data suggest that this induction is due to Sp1 phosphorylation during myogenesis and thus, utrophin expression in muscle could be regulated by treatment with phosphatase inhibitors. Control of utrophin promoter activation could then be used to increase the expression of utrophin, and thus ameliorate the symptoms of Duchenne muscular dystrophy.

USA - no Encontro que reunirá os principais pesquisadores na área de terapia gênica serão apresentados 20 artigos que falam sobre esta forma de tratamento na distrofia muscular; a maioria é experimental, em camundongos ou cães, e não trazem nenhum avanço significativo. O único trabalho em humanos (artigo 7) fala do uso de mioblastos na distrofia muscular, trabalho realizado no Canadá, e que já foi divulgado aqui mais de uma vez (estão ainda com poucos crianças com distrofia muscular de Duchenne e o tratamento está sendo realizado em apenas um músculo). Os resumos em inglês dos artigos pode ser lido aqui.

Canadá - pesquisadores identificaram um gene, o Pax7, que tem a capacidade de estimular as células tronco em células musculares. A presença desde gene é fundamental nas células regenerativas com a finalidade de corrigir lesões nos músculos. Este seria um novo caminho para aperfeiçoar a terapia gênica ou para melhorar a capacidade natural de regeneração dos músculos.

http://www.plosbiology.org/plosonline/?request=get-document&doi=10.1371/journal.pbio.0020130

Inglaterra - neste estudo os pesquisadores estudaram a terapia gênica realizada no período intrauterino, com o objetivo de curar ou retardar a evolução da doença. Utilizando um vetor viral o gene da distrofina foi administrado no 15o dia de gestação de camundongos. Após 15 meses do nascimento a expressão do gene foi observada em vários músculos como o cardíaco, diafragma, músculos intercostais, etc. Em se confirmando o sucesso desta terapia pode se constituir em uma alternativa de terapia no caso do diagnóstico da doença durante a gestação.

Canadá - o uso de mioblastos no tratamento da distrofia muscular tem sido tentado de longa data; este grupo do Canadá tem estudado minuciosamente a técnica com o objetivo de melhora-la; neste trabalho eles aqueceram as células antes do tratamento e observaram melhores resultados em laborátorio, com maior sobrevida do mioblasto. O resumo doartigo pode ser lido a seguir:

18/05/04: Myoblast survival enhancement and transplantation success improvement by Heat-Shock treatment in mdx mice NEW

Bouchentouf, Manaf; Benabdallah, Basma F.; Tremblay, Jacques P.

Transplantation. 77(9):1349-1356, May 15, 2004

Abstract

Background. Duchenne muscular dystrophy is a disease caused by the incapacity to synthesize dystrophin, which is implicated in the maintenance of the sarcolemma integrity. Myoblast transplantation is a potential treatment of this disease. However, most of the transplanted cells die very rapidly after their injection. Heat-shock proteins (HSPs) are over-expressed when cells undergo various types of stresses. Our goal was thus to investigate whether the expression of HSPs (HSP70 in particular) could protect myoblasts from death after intramuscular injection.
Methods. HSP70 expression was induced by warming the cells at 42[degrees]C for 60 minutes. HSP70 over-expression was quantified by Western blot analysis. The in vitro effect of HSPs on cell survival was evaluated by fluorescence-activated cell sorter analysis using the Hoescht/propidium iodide-labeling technique, and their in vivo effects were investigated by transplanting TnI-LacZ myoblasts labeled with [methyl-14C] thymidine.
Results. Western blots indicated a sevenfold over-expression of the HSP70 after the heat-shock treatment. In vitro, the heat-shock treatment protected 18% of the cells from staurosporine- (1 [mu]M) induced apoptosis. HSPs also protected 10% of the cells from death induced by either tumor necrosis factor-[alpha] (30 ng/mL) or glucose oxydase (0.1 U/mL). In vivo, the treatment improved the cell survival by twofold 5 days after the graft and increased by fourfold the long-term graft success.
Conclusions. The heat-shock treatment is a practical approach for improving the success of myoblast transplantation; in fact, using this kind of treatment, there is no need to genetically modify the cells before their transplantation.
 

Canadá - os vírus tem sido muitos estudados com a finalidade de levar os genes até os músculos; neste experimento os genes do vírus foram totalmente retirados; este virus contendo o gene da distrofina foi administrado ao camundongo e houve a expressão do gene em 23,6% das fibras musculares do músculo diafragma; houve uma discreta resposta inflamatória e os camundongos não receberam drogas imunossupressoras.

http://ajplung.physiology.org/cgi/content/abstract/00117.2004v1?maxtoshow=&HITS=&hits=&RESULTFORMAT=1&andorexacttitle=and&andorexacttitleabs=and&fulltext=muscular+dystrophy&andorexactfulltext=and&searchid=1085442715333_24004&stored_search=&FIRSTINDEX=0&sortspec=date&fdate=5/1/2004&resourcetype=1

USA - o camundongo mdx tem o defeito genético mas não tem a perda de força muscular e nem as alterações cardíacas. Neste estudo os pesquisadores criaram um camundongo que expressa a distrofina em 50% das células; estes camundongos receberam isoproterenol que promove lesão do músculo cardíaco e observaram que os que expressavam a distrofina em 50% das células não apresentaram lesão no músculo cardíaco. Em conclusão os pesquisadores concluem que o tratamento que promova a expressão do gene em 50% das células seria suficiente para tratamento das manifestações cardíacas da distrofia muscular.

USA - pesquisadores da Universidade de Iowa identificaram uma proteína identificada com a sigla LARGE, que pode contribuir para correção de diferentes formas de distrofia congênita e tipo cinturas. A expressão da proteína permitira restaurar a função das proteínas da membrana celular de diferentes formas de distrofia. Este estudo foi realizado em camundongos e em células de portadores de distrofia muscular. Esta notícia foi assunto em diversos jornais americanos:

Gene Therapy Restores Wasted Muscles

Muscular dystrophy discovery may lead to new treatment approaches

University of Iowa Muscular Dystrophy Discovery May Lead to New Treatment Approaches

Muscular dystrophy research advances

USA - o laboratório Wyeth divulgou que iniciou testes em pessoas não portadoras de distrofia com o myo-29, um anticorpo monoclonal que inibe a miostatina.  A miostatina é uma proteína intracelular que inibe o crescimento dos músculos. O objetivo destes testes é observar se o uso deste anticorpo é seguro e promove aumento da massa muscular. Dependendo dos resultados o myo-29 será testado em portadores de distrofia muscular. O próprio laboratório avisa que há um longo caminho até os resultados finais com esta droga. A princípio acreditá-se que este tratamento seria paliativo para aumentar a força muscular até um tratamento definitivo.

Inglaterra - o Dr. Vitor Dubowitz, especializado em doenças neuromusculares, tem uma preocupação muito grande com a divulgação de informações sobre distrofia muscular por pesquisadores. Ele acha que os termos empregados não são adequados e não condizem com a realziadade das pesquisas. Os animais com distrofia tem a mesma alteração genética mas não tem os mesmos sintomas que os pacientes e nem sempre uma terapêutica eficiente no laborátorio poderá ser transposta para a clínica. Neste artigo ele analisa a necessidade de padronização entre clínicos e pesquisadores e cuidado na informação dos resultados experimentais. O resumo do artigo em inglês poderá ser lido aqui.

(IN PRESS (Neuromuscular Disorders, 2004)) Therapeutic efforts in Duchenne muscular dystrophy; the need for a common language between basic scientists and clinicians NEW

Victor Dubowitz, UK

Abstract

Major advances in molecular genetics of Duchenne dystrophy over the past decade have generated a flurry of attempts at potential cell and gene therapy, mainly in the dystrophin-deficient mdx mouse. This has been accompanied by a fanfare of publicity, in both scientific and lay press, producing waves of hope followed by troughs of disappointment and frustration in both patients and their families and in the scientific community. It has also spawned an additional problem in the use of inappropriate terminology to describe clinical or pathological changes in experimental animal studies, which have been equated with the human disease. It seemed timely to address and hopefully redress the problem, and suggest some solutions, aimed at finding a common language for basic and clinical scientists in their therapeutic efforts in relation to Duchenne dystrophy. Core problems include equating the mdx mouse, with its very mild clinical phenotype, and Duchenne dystrophy; use of inappropriate and often emotive terminology to describe pathological changes, such as ‘rescue’, ‘reversal’, ‘prevention’, ‘phenotype’, instead of clear descriptive language; and use of the term therapy in place of experiment in both laboratory and clinical experiments targeting single muscles. A major missing link in these multidisciplinary efforts is the absence of mouse doctors, who can define at a clinical level the motor, respiratory and cardiac deficits in the dystrophic animal, and bridge the huge gap between the mouse scientists doing experimental studies in the laboratory and the clinicians and veterinarians caring for humans and dogs with these disorders.

USA -  Nesta reportagem, relatando um trabalho da Universidade de Buffalo que será publicado na revista Nature, o peptídeo do veneno de tarântula, GsMTx4, se mostrou promissor para tratamento de arritmias cardíacas, distrofia muscular e outras doenças. A ação pode ser inespecífica, relacionada a bloqueio em canais da membrana celular.

Itália - neste estudo uma fração das células tronco circulantes, a fração AC133(+),  foi injetada em camundongos com distrofia muscular; os camundongos tratados apresentaram expressão da distrofina e maior força muscular; se estas células puderem ser identificadas, isoladas e tratadas poderia ser aberto um caminho para tratamento das distrofias musculares.

USA - a óxido nítrico sintetase (NOS) é uma enzima do complexo de proteínas da membrana celular. Já havia se demonstrado que o aumenta da expressão da NOS corrigia a doença em camundongos. Nesta pesquisa os autores procuraram identificar as proteínas que se alteraram com a maior expressão da NOS. Os autores demonstraram que os níveis de distrofina não se alteraram com o aumento da NOS mas houve aumento da alfa-7-integrina, da talina e da vinculina que devem ter contribuido para a melhora da célula muscular. O resumo deste artigo pode ser lido abaixo:

(In Press: Molecular Genetics and Metabolism,2004) Expression of a NOS transgene in dystrophin-deficient muscle reduces muscle membrane damage without increasing the expression of membrane-associated cytoskeletal proteins 

James G. Tidball, and Michelle Wehling-Henricks - USA

Abstract

Muscular dystrophy that is caused by mutation of the membrane-associated, cytoskeletal protein called dystrophin, is accompanied by loss of a dystrophin-associated protein complex (DPC) that includes neuronal nitric oxide synthase (nNOS). Previous work showed that expression of a nNOS transgene in the dystrophin-deficient, mdx mouse greatly reduces muscle membrane damage. In this investigation, we test whether expression of a nNOS transgene in wild-type or mdx muscle increases expression of DPC proteins, or functionally related proteins in the integrin complex that are upregulated in dystrophin-deficiency, or affects expression of the dystrophin homolog, utrophin. Many members of the DPC are enriched in Western blots of cell membranes isolated from NOS transgenic muscle, compared to wild-type. Similarly, alfa7-integrin and the associated cytoskeletal proteins talin and vinculin are increased in NOS transgenic, non-dystrophic muscle. However, utrophin expression is unaffected by elevated NOS expression in healthy muscle. A similar trend in mRNA levels for these proteins was observed by expression profiling. Analysis of membrane preparations from mdx mice and NOS transgenic mdx mice shows that expression of the NOS transgene causes significant reductions in utrophin, talin, and vinculin. Expression profiling of mRNA from mdx and NOS transgenic mdx muscles also shows reduced expression of talin. Immunohistochemistry of mdx and NOS transgenic mdx muscle indicates that reduction in utrophin in NOS transgenic mdx muscle results from a decrease in regenerative fibers that express high levels of utrophin. Together, these findings indicate that the NOS transgene does not reduce dystrophinopathy by increasing the expression of compensatory, structural proteins.

Itália - os efeitos antimiotônicos dos derivados da mexeletina e da tocainamida foram testados em camundongos em um modelo experimental de distrofia miotônica. Estas drogas são potentes bloqueadoras dos canais de sódio e são usadas como antiarrítmicos. Todos as drogas demonstraram efeito antiomiotônico em camundongos. Este artigo será publicado em um dos próximos números da revista Neuromuscular Disorders e o resumo em inglês está abaixo:

New potent mexiletine and tocainide analogues evaluated in vivoand in vitro as antimyotonic agents on the myotonic ADR mouse

Annamaria De Luca, Sabata Pierno, Antonella Liantonio, Jean-Franc¸ois Desaphy,Fedele Natuzzi, Maria Paola Didonna, Ermanno Ferrannini, Harald Jockusch, Carlo Franchini, Giovanni Lentini, Filomena Corbo, Vincenzo Tortorellab, Diana Conte Camerino - Itália

Abstract

The antimyotonic activity of chiral derivatives of mexiletine and tocainide, selected as potent use-dependent blockers of skeletal muscle sodium channels, was evaluated in vivo acutely in myotonic ADR mice. The compounds had either aromatic (Me4 and Me6) or branched isopropyl groups (Me5 and To1) on the asymmetric centre, or had this latter one methylene apart from the amino group (Me2). Therapeutic doses of mexiletine (5–10 mg/kg) and tocainide (7–20 mg/kg) significantly reduced the long time of righting reflex (TRR), typical of ADR mice. Me4, Me5 and Me6 were 2-fold more potent than mexiletine. To1 fully normalised the TRR at 7 mg/kg. The electromyographic analysis confirmed a muscle-based activity for drug effectiveness on TRR. All the compounds reduced the myotonic hyperexcitability of intercostal muscle fibres when tested in vitro by current-clamp recordings, with a potency correlated with their action on sodium channels. On stimulus-evoked firing, the isopropyl analogues were 2–4-fold more potent than parent compounds, while the aromatic analogues were about 10-fold more potent than mexiletine. Patch-clamp recordings confirmed a normal-like pharmacological sensitivity of sodium channels of native ADR muscle fibres. Finally, the in vivo antimyotonic activity is due to the block of sodium channels and divergences with in vitro potency can be related to structure-based changes in drug pharmacokinetics.

China - pesquisadores chineses injetaram células tronco da medula óssea na veia do rabo de camundongos portadores de distrofia muscular. Após 5 a 20 semanas os pesquisadores evidenciaram aumento da expressão da distrofina e utrofina nestes camundongos. Não há relatos detalhados deste experimento.

Canadá - O transplante de mioblastos tem sido novamente estudado no Canadá. As células transplantadas tem uma vida curta por reação imunológica do paciente. Neste estudo os autores observaram em camundongos resultado positivo com o transplante de mioblastos com imunossupressão. Este grupo tem estudado todos os detalhes do transplante de mioblastos para o seu aperfeiçoamento e para que no futuro ele possa se tornar uma alternativa de tratamento.

USA - vários problemas dificultam o sucesso da terapia gênica na distrofia muscular: chegada do gene até o músculo, expressão prolongada e estável do gene, reação imunológica. Nesta pesquisa os autores prepararam um vírus com o gene da distrofina e com o CTLA41g. O tratamento com este vetor provocou a expressão estável e prolongada do gene da distrofina com pouca reação imunológica. A técnica de terapia gênica tem sido aperfeiçoada e esta é uma maneira de se melhorar o resultado do tratamento.

USA - a Conferência anual do Parent Project, realizada em julho de 2004, reuniu um grupo de renomados pesquisadores para apresentar aos portadores de Duchenne, pais e amigos, as mais recentes informações sobre tratamento e acompanhamento da doença. O material desta palestra está reunido em 25 artigos em inglês que podem ser lidos ou copiados. Infelizmente pela grande quantidade de informação e pelo tamanho dos artigos será impossível a sua tradução e comentários. Os gráficos e as informações mais importantes serão acrescentadas aos artigos do site.

USA - todos os pesquisadores concordam que o método para levar os genes para os músculos é a maior dificuldade para a terapia gênica. Os pesquisadores descrevem um método que não utiliza vetores virais e que é considerado fácil para levar os genes para os músculos. Utilizando plasmídeos os pesquisadores obtiveram sucesso na terapia gênica experimental para os músculos dos membros. O resumo do artigo em inglês que será publicado em breve está abaixo:

( Molecular Therapy. 2004,10(2):386-398) A Facile Nonviral Method for Delivering Genes and siRNAs to Skeletal Muscle of Mammalian Limbs

James E. Hagstrom, Julia Hegge, Guofeng Zhang, Mark Noble, Vladimir Budker, David L. Lewis, Hans Herweijer and Jon A. Wolff  - USA
 

Abstract

Delivery is increasingly being recognized as the critical hurdle holding back the tremendous promise of nucleic acid-based therapies that include gene therapy and more recently siRNA-based therapeutics. While numerous candidate genes (and siRNA sequences) with therapeutic potential have been identified, their utility has not yet been realized because of inefficient and/or unsafe delivery technologies. We now describe an intravascular, nonviral methodology that enables efficient and repeatable delivery of nucleic acids to muscle cells (myofibers) throughout the limb muscles of mammals. The procedure involves the injection of naked plasmid DNA or siRNA into a distal vein of a limb that is transiently isolated by a tourniquet or blood pressure cuff. Nucleic acid delivery to myofibers is facilitated by its rapid injection in sufficient volume to enable extravasation of the nucleic acid solution into muscle tissue. High levels of transgene expression in skeletal muscle were achieved in both small and large animals with minimal toxicity. Evidence of siRNA delivery to limb muscle was also obtained. The simplicity, effectiveness, and safety of the procedure make this methodology well suited to limb muscle gene therapy applications.

Canadá - este grupo de pesquisa, liderado por Jacques P. Tremblay, tem estudado novas técnicas para aperfeiçoar o transplante de mioblastos. Neste estudo, que será publicado em breve na Revista Molecular Therapy (resumo em inglês abaixo) eles estudaram uma nova técnica para correção dos mioblastos e células tronco dos músculos para poder utilizar as próprias células do paciente neste tratamento. A possibilidade de correção das células do próprio paciente poderia contribuir para melhorar o resultado deste tipo de tratamento.

(In Press: Molecular Therapy, 2004) Nucleofection of Muscle-Derived Stem Cells and Myoblasts with C31 Integrase: Stable Expression of a Full-Length-Dystrophin Fusion Gene by Human Myoblasts NEW

Simon P. Quenneville,Pierre Chapdelaine,JoJl Rousseau, Jean Beaulieu, Nicolas J. Caron, Daniel Skuk, Philippe Mills, Eric C. Olivares, Michele P. Calos, and Jacques P. Tremblay - Canada

Ex vivo gene therapy offers a potential treatment for Duchenne muscular dystrophy by transfection of the dystrophin gene into the patient’s own myogenic precursor cells, followed by transplantation. We used nucleofection to introduce DNA plasmids coding for enhanced green fluorescent protein (eGFP) or eGFP-dystrophin fusion protein and the phage C31 integrase into myogenic cells and to integrate these genes into a limited number of sites in the genome. Using a plasmid expressing eGFP, we transfected 50% of a mouse muscle-derived stem cell line and 60% of normal human myoblasts. Co-nucleofection of a plasmid expressing the C31 integrase and an eGFP expression plasmid containing an attB sequence produced 15 times more frequent stable expression, because of site-specific integration of the transgene. Co-nucleofection of the C31 integrase plasmid and a large plasmid containing the attB sequence and the gene for an eGFP–full-length dystrophin fusion protein produced fluorescent human myoblasts that were able to form more intensely fluorescent myotubes after 1 month of culture. A nonviral approach combining nucleofection and the C31 integrase may eventually permit safe autotransplantation of genetically modified cells to patients.

USA - pesquisadores estudando um modelo experimental de distrofia, o verme Caenorhabditis elegans, identificaram uma nova proteína que pode estar envolvida com a doença. A SNF-6 é um transportadora de acetilcolina/colina e sua ausência pode também causar degeneração muscular, e causar sintomas indistinguíveis da distrofia muscular. Esta proteína parece interagir com as proteínas da membrana e pode contribuir para a patogenia da doença. Um resumo em inglês do artigo publicado nesta semana na revista Nature está a seguir:

IN PRESS: Nature, 2004) SNF-6 is an acetylcholine transporter interacting with the dystrophin complex in Caenorhabditis elegans

Hongkyun Kim, Matthew J. Rogers, Janet E. Richmond & Steven L. McIntire - USA

Muscular dystrophies are among the most common human genetic diseases and are characterized by progressive muscle degeneration. Muscular dystrophies result from genetic defects in components of the dystrophin–glycoprotein complex (DGC), a multimeric complex found in the muscle cell plasma membrane. The DGC links the intracellular cytoskeleton to the extracellular matrix and is thought to be important for maintaining the mechanical integrity of muscles and organizing signalling molecules. The exact role of the DGC in the pathogenesis of disease has, however, remained uncertain. Mutations in Caenorhabditis elegans DGC genes lead to specific defects in coordinated movement and can also cause muscle degeneration. Here we show that mutations in the gene snf-6 result in phenotypes indistinguishable from those of the DGC mutants, and that snf-6 encodes a novel acetylcholine/choline transporter. SNF-6 mediates the uptake of acetylcholine at neuromuscular junctions during periods of increased synaptic activity. SNF-6 also interacts with the DGC, and mutations in DGC genes cause a loss of SNF-6 at neuromuscular junctions. Improper clearing of acetylcholine and prolonged excitation of muscles might contribute to the pathogenesis of muscular dystrophies.

USA - continuando seus estudos está equipe realizou a terapia gênica utilizando-se de um vetor não viral em camundongos com distrofia, injetando-o diretamente na artéria. Após 6 meses apenas 1-5% das miofibras expressaram a distrofina. Houve resposta imunológica a este tratamento com aparecimento de anticorpos.

Japão - neste artigo que será publicado em breve na Revista Molecular Therapy (cujo resumo em inglês segue abaixo) os autores descrevem um experimento em camundongos com distrofia muscular que receberam o minigene da distrofina. Apesar de uma pequena quantidade de fibras expressarem a distrofina houve uma significativa melhora das alterações patológicas do músculo e aumento da força muscular.

(IN PRESS: Molecular Therapy, 2004) AAV Vector-Mediated Microdystrophin Expression in a Relatively Small Percentage of mdx Myofibers Improved the mdx Phenotype NEW

Madoka Yoshimura, Miki Sakamoto, Madoka Ikemoto, Yasushi Mochizuki, Katsutoshi Yuasa, Yuko Miyagoe-Suzuki, and Shin’ichi Takeda - Japan

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a lethal disorder of skeletal muscle caused by mutations in the dystrophin gene. Adeno-associated virus (AAV) vector-mediated gene therapy is a promising approach to the disease. Although a rod-truncated microdystrophin gene has been proven to ameliorate dystrophic phenotypes, the level of microdystrophin expression required for effective gene therapy by an AAV vector has not been determined yet. Here, we constructed a recombinant AAV type 2 vector, AAV2-MCKDCS1, expressing microdystrophin (DCS1) under the control of a muscle-specific MCK promoter and injected it into TA muscles of 10-day-old and 5-week-old mdx mice. AAV2-MCKDCS1-mediated gene transfer into 5-week-old mdx muscle resulted in extensive and long-term expression of microdystrophin and significantly improved force generation. Interestingly, 10-day-old injected muscle expressed microdystrophin in a limited number of myofibers but showed hypertrophy of microdystrophin-positive muscle fibers and considerable recovery of contractile force. Thus, we concluded that AAV2-MCKDCS1 could be a powerful tool for gene therapy of DMD

Coréia do Sul - os pesquisares estudaram os efeitos dos exercícios na morte das células dos camundongos com distrofia muscular e observaram que o corticóide reduz a morte celular  em camundongos submetidos a exercícios. O resumo deste  artigo que será publicado em breve pode ser lido abaixo:

(Early view: Muscle and Nerve, 2004):Effects of exercise and steroid on skeletal muscle apoptosis in the mdx mouse NEW

Jeong-Hoon Lim, MD, Dai-Youl Kim, MD, Moon Suk Bang, MD, PhD - Republic of Korea

Abstract: Reports concerning the influence of exercise loading and steroid administration on dystrophinopathy are inconsistent. To investigate the effect of muscle exercise in Duchenne muscular dystrophy (DMD), 15 control and 15 mdx mice, an animal model of DMD, were divided into free-living (n = 6), exercise (n = 6), and immobilization (n = 3) groups. Free- living and exercise groups were further divided into steroid- treated and sham-treated groups to evaluate the effect of steroid administration. We measured apoptotic changes by in
situ DNA nick-end labeling (TUNEL), DNA fragmentation assay, and Western blotting for Bcl-2 and BAX. Apoptosis was most prominent in the sham-treated exercise group, and it was significantly reduced in the steroid-treated exercise group. The steroid-treated free-living group showed a higher rate of apoptotic change than the sham-treated free-living group. Apoptosis was minimized in the free-living condition, whereas exercise loading and immobilization caused apoptotic change in this muscular dystrophy animal model. Steroid administration induced apoptosis in muscle of free-living mice, but alleviated the apoptotic damage caused by exercise loading in mdx mice. These findings suggest that steroid administration may be effective in preventing a postexercise deterioration of skeletal muscle in animal models of DMD. 

Itália - o exercício agrava a distrofia nos camundongos. Neste trabalho os autores demonstraram que há uma alteração do equilíbrio do cálcio nos músculos dos camundongos com distrofia muscular o que pode contribuir para agravamento da lesão muscular e pode contribuir para o conhecimento dos mecanismos de lesão muscular na distrofia. O resumo em inglês do artigo pode ser lido a seguir:

(IN PRESS: Neurobiology of Disease, 2004) The alteration of calcium homeostasis in adult dystrophic mdx muscle fibers is worsened by a chronic exercise in vivo NEW

Bodvael Fraysse, Antonella Liantonio, Michela Cetrone,Rosa Burdi, Sabata Pierno, Antonio Frigeri, Michela Pisoni,Claudia Camerino, and Annamaria De Lucaa - Italy

Chronic exercise in vivo aggravates dystrophy in mdx mice. Calcium homeostasis was evaluated ex vivo by micro-spectrofluorometry on tendon-to-tendon dissected extensor digitorum longus (EDL) muscle fibers. Resting cytosolic calcium ([Ca2+]i) and sarcolemmal permeability through Gd3+-sensitive mechanosensitive calcium (MsCa) channel were significantly higher in mdx vs. wild-type fibers. The exercise further enhanced [Ca2+]i in mdx fibers and increased sarcolemmal permeability by activating nifedipine-sensitive leak calcium channels. The two genotypes did not differ in caffeine sensitivity and in the excitation-calcium release (ECaR) coupling mechanism by K+ depolarization. The exercise produced a similar adaptation of activation curve of ECaR and of sensitivity to caffeine. However, the inactivation of ECaR of mdx fibers did not adapt to exercise. No fiber phenotype transition occurred in exercised muscle. We provide the first evidence that an in vivo exercise worsens the impaired calcium homeostasis of dystrophic fibers, supporting the role of enhanced calcium entrance in dystrophic progression.

USA - pesquisadores desenvolveram um camundongo geneticamente modificado que apresenta maior capacidade de correr do que os camundongos normais. Os camundongos apresentam uma alteração de um gene ligado ao receptor da insulina; este camundongo poderá ajudar nos estudos de drogas para obesidade, doenças lipídicas e nas distrofias musculares.  Os comentários sobre este artigo também podem ser lidos aqui.

USA - utilizando um modelo de distrofia muscular canino os pesquisadores realizaram transplante de células tronco da medula óssea. A análise dos músculos antes e após o transplante não demonstraram aumento da expressão da distrofina nos músculos.

Austrália -  O IGF-1 é um fator que está relacionado ao aumento da massa muscular e há vários pesquisadores estudando seu efeito em modelos de distrofia muscular. Neste artigo os pesquisadores estudaram os músculos de camundongos tratados com IGF-1  e observaram que ocorre redução da fadiga nos músculos dos animais que receberam o tratamento. O resultado é importante pois se for comprovado este efeito em seres humanos, a droga pode reduzir a fadiga em todos os tipos de distrofia muscular. O artigo será publicado em breve e o resumo segue abaixo:

(IN PRESS: Muscle and Nerve, 30:295-304, 2004): ADMINISTRATION OF INSULIN-LIKE GROWTH FACTOR-I IMPROVES FATIGUE RESISTANCE OF SKELETAL MUSCLES FROM DYSTROPHIC mdx MICE NEW

PAUL GREGOREVIC, , DAVID R. PLANT, , and GORDON S. LYNCH, - Australia

ABSTRACT: Muscle fatigue occurs in many neuromuscular diseases, including the muscular dystrophies, and it contributes to a loss of functional capacity and reduced quality of life for affected patients. An improvement in fatigue resistance has been observed in diaphragm muscles of mdx mice following insulin-like growth factor-I (IGF-I) administration. Whether similar treatment can improve locomotor muscle function in mdx mice is not known. We examined the ef.cacy of IGF-I administration (1 mg/kg daily s.c. for 8 weeks) on structural, metabolic, and functional properties of extensor digitorum longus (EDL) and soleus muscles of mdx mice, and tested the hypothesis that IGF-I treatment would improve function in these muscles. After treatment, muscles were more resistant to fatigue during repeated maximal contractions than muscles from untreated mice, an improvement associated with increased muscle .ber succinate dehydrogenase activity in the absence of changes in cellular (single-.ber) contractile activation characteristics. The findings have important clinical implications, not just for the dystrophinopathies, but for all neuromuscular pathologies where fatigue of locomotor muscles limits functional capacity and decreases quality of life

USA - um dos problemas não plenamente solucionados da terapia gênica é a resposta imunológica. Nesta pesquisa, cujo resumo está transcrito abaixo, os autores utilizaram um vetor viral que continha o gene da distrofina e um gene inibidor da resposta imunológica. Os resultados demonstraram que a inibição da reposta imunológica promove uma expressão rolongada do gene da distrofina nos músculos.

(IN PRESS: Molecular Therapy, 2004) Sustained Muscle Expression of Dystrophin from a High-Capacity Adenoviral Vector with Systemic Gene Transfer of T Cell Costimulatory Blockade NEW

Zhilong Jiang, Gudrun Schiedner, Nico van Rooijen, Chau-Ching Liu, Stefan Kochanek, and Paula R. Clemens - USA

Adenoviral vector (Ad)-mediated gene delivery of normal, full-length dystrophin to skeletal muscle provides a promising strategy for the treatment of Duchenne muscular dystrophy (DMD). However, cellular and humoral immune responses induced by vector gene transfer limit the application of this approach. Blockade of the costimulatory interaction between naRve T cells and antigen-presenting cells has proven to be a successful means to diminish immunity induced by gene transfer. In this study we explore the potential of supplementing dystrophin gene delivery to dystrophin-deficient Dmd mouse skeletal muscle with systemic gene delivery of CTLA4Ig and CD40Ig molecules to effect costimulatory blockade. We found that systemic administration of a high-capacity Ad (HC-Ad) vector carrying murine CTLA4Ig (AdmCTLA4Ig) either alone or codelivered with an HC-Ad vector carrying murine CD40Ig (AdmCD40Ig) provided sustained expression of recombinant full-length murine dystrophin from an HC-Ad vector carrying the dystrophin cDNA (AdmDys). The level of AdmDys vector genomes remained stable in animals cotreated with systemic delivery of vectors carrying molecules to block costimulation. In addition, muscle CD4+ and CD8+ T cell infiltrates and Th1 cytokine production by splenocytes were reduced. The production of neutralizing antibody against Ad vector was significantly inhibited in mice receiving systemic codelivery of both AdmCTLA4Ig and AdmCD40Ig, but not in the mice treated with AdmCTLA4Ig alone. The results suggested that coblockade of both CD28/B7 and CD40L/CD40 costimulatory pathways is required for effective inhibition of the Ad vector-induced humoral immune response in Dmd mice, whereas blockade of CD28/B7 alone by murine CTLA4Ig would be sufficient for prolonged dystrophin expression in treated muscle.

USA - a miostatina é uma proteína que causa atrofia muscular; a ausência de miostatina causa hipertrofia dos músculos, com aumento da força muscular. Camundongos sem miostatina tem 70% mais músculos que os camundongos normais. Estes camundongos tem maior massa óssea também o que permitirá entender melhor os mecanismos que relacionam a osteoporose na distrofia muscular, mesmo em crianças que ainda deambulam. Provavelmente a quantidade de músculos pode ser importante na prevenção da osteoporose.

USA - a utrofina é uma proteína que pode substituir as funções da distrofina; ela esta aumentada na fase embrionária e se for estimulada no indivíduo adulto ela pode exercer as funções da distrofina e melhor os sintomas da distrofia. Há inúmeros estudos a respeito de drogas que possam estimular a produção de utrofina. Uma destas drogas é a heregulina. Neste estudo em camundongos foi injetado um peptídeo semelhante a heregulina e os pesquisadores observaram diminuição das lesões musculares em camundongos portadores de distrofia.

USA - a TGF- beta 1 é uma proteína muscular que pode contribuir para o aparecimento de fibrose e agravar a doença muscular. Neste trabalho em camundongos com distrofia muscular os autores identificaram aumento da TGF-beta 1 da 6a a 9a semana de vida; o bloqueio da TGF-beta 1 com a droga decorin reduziu em 40% as fibras colágenas no diafragma. Os autores concluem que tratamentos que reduzem a TGF-beta 1 podem reduzir a fibrose na distrofia muscular.

USA - os autores estudaram a capacidade de regeneração das células tronco não musculares em um modelo experimental em camundongos. Menos de 1% das células expressaram o gene, indicando que o recrutamento de células não musculares foi muito baixo. Estudos como este devem ajudar a entender o papel das células tronco e encontrar um modo de induzí-las a participar da regeneração muscular.

Brasil -  este estudo realizado na Universidade Federal Fluminense tem commo objetivo avaliar os efeitos do sexo do camundongo nas alterações musculares da distrofia, a capacidade de regeneração e a quantidade de fibrose dos músculos.  A análise dos músculos demonstrou que as fêmeas tem menor inflamação muscular, menor necrose e maior regeneração muscular que os camundongos machos em torno da 6a semana de vida. A retirada dos ovários reduziu a regeneração muscular. Camundongos velhos, tanto machos ou fêmeas, apresentam o mesmo grau de lesão muscular. Os autores concluíram que há uma influência dos hormônios femininos na necrose dos músculos e que estes podem promover regeneração  e reduzir a inflamação muscular.

Canadá - os corticóides, em especial o deflazacort, podem retardar a evolução da distrofia muscular de Duchenne mas o mecanismo de ação é desconhecido. Neste estudo em camundongos os pesquisadores demonstraram que o deflazacort reduz a necrose muscular, provavelmente pela ativação da via da calcineurina/NF-AT1.

São Paulo - em 2003 eu decidi realizar pesquisas com camundongos com distrofia muscular na Faculdade de Medicina da Fundação do ABC, além de apoiar as pesquisas que estão sendo realizadas em Ribeirão Preto, no Centro de Pesquisas em Distrofia Muscular da AADM. O meu primeiro estudo experimental foi aprovado para apresentação no 44o Encontro Anual da Sociedade Americana em Biologia Celular. Neste trabalho eu estudei a droga tamoxifeno, que é utilizada para tratamento de mulheres com câncer de mama. Eu decidi estudar esta droga porque ela atua sobre as TGF beta, um grupo de proteínas que está alterado na distrofia muscular de Duchenne. Para este estudo eu utilizei a droga nos camundongos mdx, que tem uma mutação do gene da distrofina. Os animais que receberam a droga apresentaram aumento da força muscular após a quinta semana que se manteve até o final do experimento na 12a semana. Biópsias musculares foram realizadas e estão ainda sob análise (no Centro de Estudos do Genoma Humano). As primeiras análises demonstram que os animais tratados com tamoxifeno tem menor grau de degeneração muscular do que os não tratados. Há ainda outros estudos bioquímicos que estão sendo realizados nos músculos dos animais cujos resultados serão conhecidos em breve. Neste mês estamos iniciando o estudo de uma segunda droga no mesmo modelo experimental. O resumo do meu trabalho que será apresentado em Washington, USA, em dezembro de 2004 é o seguinte:

Tamoxifen increases muscular strength of the mdx dystrophic mice NEW

(Abstract from 44th Annual Meeting - American Society for Cell Biology (December, 4-8, 2004, Washington)

A. Cavalsan,1 R. F. Vasquez,1 R. C. Lin,1 S. B. Zyngier,1 F. J. Velloso,2 B. H. Santos,2 L. L. Fogaca,2 M. Vainzof,2 D. Feder1 ; 1 Pharmacology, ABC Faculty of Medicine, Santo Andre, Brazil, 2 Human Genome Research Center - IB USP, Sao Paulo, Brazil

The mdx mice is a well-known model of Xp21 dystrophin-deficient muscular dystrophy. Although a good genetic and biochemical model, the mdx shows no muscle weakness, but under physical exercise, a loss of muscular strength can be detected. Here we have tested the possible therapeutic beneficial effect of Tamoxifen in the degenerative process of the dystrophic muscle, analyzing muscle strength of tamoxifen treated mdx mice, under intensive physical exercise. A total of 22 mices aged 4 weeks were divided into 3 groups: control (n= 8) treated with 0.5 mL saline ip, Tamoxifen 5 mg/Kg body weight ip (n= 8) daily and Tamoxifen 10 mg/Kg ip (n=6) daily. The exercise protocol was done in a wheel revolving at 18 cm/s, for 10 minutes, twice a day, 5 days/week, up to 12 weeks. Whole-body strength was measured weekly using a force transducer coupled to a computer. Mice tails were attached via a non-flexibile nylon cord to the transducer, the animals were electricly stimulated to run, and the force to pull the cord was registered continuously. Results were analyzed by the Kruskal-Wallis test. The mice treated either with 5 mg/Kg (6.26+ 1.44 dynes/g body weight) or 10 mg/Kg (6.46+ 2.52) showed a significant increase of muscular strength (p<0.05) compared to the control group (3.66+ 0.77) starting in the 5th week, and maintaining significance up to the end of the experiment. Histological and histochemical analysis of the complex of the gastrocnemius muscle are under analysis, but preliminary results suggest a less degree of degeneration in the Tamoxifen treated groups.
Tamoxifen is an anti tumoral drug and act on TGF-beta. Its possible therapeutic effect in the degenerative process of the dystrophic muscle could ameliorates the clinical course of dystrophic patients. FAPESP-CEPID, CNPq, PRONEX, NEPAS-FMABC.

USA - neste Congresso que se realizará em dezembro em Washington, além da minha pesquisa sobre tamoxifeno outros estudos serão apresentados:

1) um estudo fala dos resultados positivos com o uso do gene da distrofina retiniana humana utilizado em camundongos sem distrofina e utrofina que melhoram os sintomas musculares; de uma forma severa de distrofia eles passaram a apresentar poucos sintomas musculares;

2) o segundo estudo fala da relação entre calcificação ectópica de musculos com distrofia muscular pode ser um sinal de regeneração e auxiliar na avaliação do tratamento com medicamentos;

3) o terceiro estudo trata dos níveis de protoglicans em distrofia muscular de Duchenne em relação às outras formas da doença; há redução dos níveis de protoglicans em Duchenne pode estar relacionado aos altos níveis de TGF beta e TNF

4) O quarto estudo demonstra que as células tronco originadas de músculos de camundongos fêmeas com distrofia muscular são mais eficientes para a terapia gênica do que as células dos machos.

Os resumos em inglês destes estudos estão a seguir:

Human Retinal Dystrophin Transgene Converts Lethal Muscular Dystrophy into Viable Mild Myopathy in Dystrophin-Utrophin Null Mice
R. Gaedigk,1,2 D. J. Law,3 K. M. Fitzgerald-Gustafson,4,2 S. G. McNulty,1 N. N. Nsumu,1 A. C. Modrcin,5 R. J. Rinaldi,5 D. Pinson,6 S. C. Fowler,7 M. Bilgen,4,8 J. Burns,9 S. D. Hauschka,10 R. A. White1,2 ; 1 Medical Research, Children's Mercy Hospitals & Clinics, Kansas City, MO, 2 Pediatrics, UMKC School of Medicine, Kansas City, MO, 3 School of Biological Sciences, Univ. of Missouri-Kansas City, Kansas City, MO, 4 Hoglund Brain Imaging Center, Univ. of Kansas Medical Center, Kansas City, KS, 5 Rehabilitation Medicine, Children's Mercy Hospitals & Clinics, Kansas City, MO, 6 Pathology & Laboratory Medicine, Univ. of Kansas Medical Center, Kansas City, KS, 7 Pharmacology & Toxicology, Univ. of Kansas, Lawrence, KS, 8 Molecular & Integrative Physiology, Univ. of Kansas Medical Center, Kansas City, KS, 9 Veterinary Imaging Services, Topeka, KS, 10 Biochemistry, Univ. of Washington, Seattle, WA

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a progressive muscle disease caused by severe dystrophin gene mutations that often result in death by the third decade. The mdx mouse is the most commonly used DMD model. Although they lack dystrophin and have underlying muscle disease, mdx mice appear physically normal. This may be partially due to compensatory expression of the dystrophin-related protein, utrophin. In contrast, double mutant mice (DM), deficient for both dystrophin and utrophin (mdx/+, utrn -/-), die by 3 months of age and suffer from severe muscle weakness, pronounced growth retardation, kyphosis, weight loss, slack posture, and immobility (Deconinck et al. (1997) Cell 90: 717-727; Grady et al. (1997) Cell 90: 729-738). These features make them an excellent physiological model for DMD research. The capacity of a naturally occurring isoform, human retinal dystrophin (Dp260), to compensate for the missing muscle isoform Dp427 was tested in DM mice. The expression of this transgene prevents premature death and reduces the severe muscular dystrophy phenotype to a mild myopathy. Electromyography (EMG), histology, radiography, magnetic resonance imaging, and behavior studies show that DM transgenic mice grow normally, have normal spinal curvature and locomotion, and have reduced muscle pathology. EMG and histologic data from transgenic DM mice are typical of mild myopathy, while the DM mice exhibit severe abnormalities commonly seen in human dystrophinopathies. The expression of human Dp260 in DM mice converts a severe and lethal muscular dystrophy into a non-lethal mild myopathy. Muscle-specific expression of Dp260 could have several advantages over other treatments of DMD

Visualization of Ectopic Calcification in mdx Mouse Skeletal Muscle
N. Kikkawa, T. Ohno, M. Shiozuka, R. Matsuda; The Graduate School of Arts and Sciences, The University of Tokyo, Tokyo, Japan

It has been demonstrated that osteogenic differentiation of skeletal muscle cells are induced by osteogenic factors, such as bone morphogenetic proteins, both in vitro and in vivo. Spontaneous ectopic bone formation in vivo has also been reported in, for instance, fibrodysplasia ossificans progressiva, which is a rare bone disorder. Another example of self-generating ectopic calcification has been found in skeletal muscle of mdx mouse, a model of Duchenne muscular dystrophy (DMD).
We observed the ectopic calcification in mdx mouse thigh muscle by using x-ray micro CT-scanner SkyScan-1074, which gives resolution of 22um. The x-ray images were reconstructed into three dimentional visions. Calcifications were found as spicular structures running parallel to the muscle fiber. Paraffin sections of the regions found by X-ray microtomography were Von Kossa stained to confirm calcium deposits. We also detected ectopic calcifications of living mice with mouse-whole-body x-ray CT-scanner of Aloka. No ectopic calcification was observed in skeletal muscle of B10 mouse, which possesses normal dystrophin gene and was used as a negative control.
Calcified regions of mdx mouse thigh did not overlap with the Evans blue-positive areas but corresponded to some of the regenerating areas. Thus, ectopic calcification can be a diagnostic marker of muscle regeneration in mdx mice, and be available to determine the effects of drug or gene therapies.

Muscle Proteoglycan Levels in Duchenne Muscular Dystrophy Differ from Other Muscular Dystrophies
S. Zanotti, E. Canioni, F. Cornelio, L. Morandi, M. Mora; Neuromuscular Diseases and Neuroimmunology, National Neurological Institute C. Besta, Milano, Italy

Biglycan and decorin are small leucine-rich extracellular proteoglycans that interact with several matrix proteins particularly collagens, and also with cytokines whose activity they may modulate. To better understand the role of these proteoglycans in muscle fibrosis in muscular dystrophies, we investigated the expression of their transcripts and proteins in several forms of muscular dystrophy compared to age-matched controls. mRNAs of both proteoglycans were significantly downregulated in Duchenne muscular dystrophy and significantly upregulated in Becker muscular dystrophy, sarcoglycanopathies and dysferlinopathy. By immunohistochemistry, decorin and biglycan were mainly localized in connective tissue and apparently increased with age. Their presence increased in relation to increased fibrosis in all types of dystrophic muscle.
The increase in biglycan and decorin in most muscle diseases indicates a role of these proteoglycans in the extracellular matrix organization. The significant decrease of decorin and biglycan mRNA in DMD distinguishes this disease from the other studied and may be related to the high levels of TGF-beta1 and TNF-alpha found in this disease.

Sex Differences in Muscle Stem Cell Transplantation Efficiency
B. Deasy,1 A. Lu,1 K. Urish,1 J. Tebbets,1 B. Gharaibeh,1 R. Rubin,2 J. Huard1 ; 1 University of Pittsburgh, Pittsburgh, PA, 2 Allegheny General Hospital, Pittsburgh, PA

We previously demonstrated that muscle-derived stem cells (MDSCs) efficiently regenerate skeletal muscle tissue after transplantation into dystrophic mdx mice, which model muscular dystrophy. Here we show that transplantation of female MDSC (F-MDSC) rather than male MDSCs (M-MDSC) significantly improves skeletal muscle regeneration.
We transplanted F-MDSCs into the gastrocnemius muscles of female mdx mice and the same number of M-MDSCs into the gastrocnemius muscles of male mdx mice. We used a previously described protocol to measure the cells’ regeneration index (RI)_the number of dystrophin-positive fibers in the host muscle per 105 donor cells_two weeks after transplantation. The F-MDSCs elicited significantly superior muscle regeneration equivalent to a 6-fold increase in efficiency (F-MDSC RI=686±120 versus M-MDSCs RI=105±25, P< 0.01). Sex-crossed transplantation also demonstrated the same trend for the donor cells. We hypothesize that this difference may be related to reduced ability of the M-MDSC to self-renew or to tolerate hypoxic stress. F-MDSCs maintained CD34 expression (>80% of total cells) for up to 200 population doublings, whereas M-MDSCs exhibited a rapid drop in CD34 expression (from >80% to <30% of total cells) after only 45 population doublings. To support the notion that the F-MDSC are more tolerant to stress, we also found that proliferation of F-MDSC was less affected by low O2 conditions as compared with M-MDSC.
Our discovery of sex-related differences in muscle stem cell biology reveals clear limitations to using male stem and progenitor cells for cell-tracking purposes. This finding also warrants careful consideration by researchers working to identify optimal populations of stem and progenitor cells for use in cell therapy and tissue engineering, clinicians who perform bone marrow stem cell transplantation, and basic scientists investigating cell and developmental biology.

USA - a hemofilia é uma doença genética que causa hemorragias por falta de um fator de colagulação; neste artigo os autores descrevem sucesso a longo prazo (3 anos) com a terapia gênica de cães com hemofilia que receberam por via vascular vírus contento o gene da hemofilia que se expressou nos músculos dos cães levando a correção da doença. Esta mesma técnica pode ser utilizada na distrofia muscular.

USA -  a terapia gênica o mais precoce possível poderia impedir a degeneração muscular. Neste estudo os pesquisadores demonstram um bom resultado com o uso da terapia gênica intrauterina em camundongos com distrofia muscular. A terapia gênica na fase intrauterina seria muito importante mas difícil de se realizar pela dificuldade do diagnóstico tão precoce (só se já houvessem outros casos na família seria tentado o diagnóstico tão precoce).

Austrália - Igf-1 tem sido estudada para aumentar a força muscular na distrofia muscular. Neste estudo os pesquisadores criaram um camundongo com distofia muscular e que produzia grande quantidade de Igf-1. Os resultados demonstraram que Igf-1 reduz a necrose muscular precoce neste camundongo abrindo a possibilidade que o aumento da Igf-1 possa uma forma de retardar a evolução da distrofia muscular.

Canadá - neste Congresso realizado em Toronto de 26 a 30 de outubro de 2004 foram apresentados apenas dois trabalhos relatando experimentos em terapia das distrofias musculares.

No primeiro trabalho realizado nos Estados Unidos os pesquisadores apresentam uma nova forma de terapia gênica em camundongos; eles associaram ao vetor viral uma proteína (fator de crescimento do endotélio vascular); com esta terapia os camundongos passaram a expressar distrofina em quantidade suficiente para reduzir os sintomas da doença. O vetor viral foi injetado em uma veia, que é um passo importante para poder tratar todos os músculos; a forma de administração do gene da distrofia muscular é um dos problemas ainda não resolvido na terapia gênica da doença.

No segundo trabalho os pesquisadores holandeses estudam os oligonucleotídeos para "consertar" o gene da distrofina. Estudando células musculares humanas em laboratório ou camundongos com distrofia muscular eles tem conseguido demonstrar que esta forma de tratamento é viável. Estes oligonucleotideos tem que ser construidos para cada forma de mutação do gene e eles tem desenvolvido vários destes oligonucleotideos para utilização em seres humanos.

Os resumos destes dois trabalhos em inglês:

1) Body-wide delivery of a microdystrophin gene via intravascular administration of rAAV6 vectors for treatment of muscular dystrophy. P. Gregorevic, M. Blankinship, J. Allen, L. Meuse, S. Abmayr, J. Han, J. Chamberlain. Senator Paul D. Wellstone Muscular Dystrophy Cooperative Research Center, Dept. of Neurology, University of Washington, Seattle, WA.

   Severe neuromuscular disorders, such as Duchenne muscular dystrophy (DMD), lead to reduced quality of life and premature mortality. Historically, genetic interventions for these diseases have been limited by an inability to achieve widespread gene transfer to the affected tissues. Here we demonstrate a method that, for the first time, enables transduction of the vast majority of both the cardiac and skeletal musculature of adult mammals via a single intravenous administration of pseudotype 6 recombinant adeno-associated virus (rAAV6) vectors. As a means to enhance gene transfer, we have determined that IV coadministration of vascular endothelium growth factor (VEGF) with rAAV6 vectors can significantly increase vector accumulation and transgene expression in striated muscles. Having established in reporter gene studies that this technique enables tolerable, high-level transgene expression, we sought to evaluate the potential of this technique for delivering a therapeutic transgene to the musculature of the mdx dystrophic mouse, a model of DMD. Using this technique, we have observed that treated mdx mice exhibit expression of microdystrophin throughout the striated musculature in a manner that is sufficient to reduce pathological features of the dystrophic phenotype. Compared with untreated mice, the muscles of treated animals exhibit reduced susceptibility to contraction-induced injury, and reduced serum creatine kinase levels, reflecting a global reduction in muscle degeneration. These data are the first to demonstrate body-wide amelioration of symptoms associated with dystrophin deficiency in an adult animal following a genetic intervention. In subsequent studies we have established that these techniques can be adapted to express alternate transgenes for the treatment of other muscle diseases. We are currently undertaking studies to determine whether the existing techniques are effective in animals more similar in size and immunology to humans, and present relevant data summarizing our progress

2) Therapeutic antisense-induced exon skipping for Duchenne muscular dystrophy. A. Aartsma-Rus1, A. Janson1, G. Platenburg2, M. Bremmer-Bout1, J.T. Den Dunnen1, J.C.T. Van Deutekom1, G-J.B. Van Ommen1. 1) LUMC, Leiden, the Netherlands; 2) Prosensa, Leiden, the Netherlands.

   The severe Duchenne muscular dystrophy (DMD) is mostly caused by frame disrupting mutations in the dystrophin gene, which result in non-functional proteins. Mutations that keep the reading frame intact give rise to internally deleted, semi-functional dystrophins and result in the milder Becker muscular dystrophy (BMD). Antisense oligonucleotides (AONs) have the potential to modulate the pre-mRNA splicing such that a specific exon is skipped. As a result, the reading frame can be restored, which allows the synthesis of a BMD-like dystrophin.
   We have recently demonstrated the skipping of 20 different human DMD exons using 2'-O-methyl RNA AONs with a full-length phosphorothioate backbone (2OMePS), and confirmed the therapeutic applicability of this strategy in cultures from 10 different DMD patients. We now compare the efficacy and efficiency of 2OMePS AONs to morpholino, locked nucleic acid (LNA) and peptide nucleic acid (PNA) AONs. While LNA was most efficient in inducing exon skipping, we find that it acts in a less sequence-specific manner, probably due to its extremely high RNA affinity. Awaiting further improvements in oligochemistry, we therefore consider 2OMePS AONs currently the most favourable compounds.
   To facilitate clinical application, multiple in vivo studies in animal models are ongoing to develop safe and efficient AON-delivery methods. However, as exon skipping is a sequence-specific therapy, it is desirable to directly target the human DMD gene. We have therefore set up sequence-specific human exon skipping in vivo in transgenic mice carrying the an intact copy of the full-length 2.5 Mb human gene (hDMD). We injected 2OMePS AONs targeting human exons 44, 46 and 49 into the m. gastrocnemicus of hDMD mice, and showed skipping of the human (but not the murine) exons, which persisted for at least 28 days. Based on pre-clinical data obtained by our group and others, we are currently setting up a clinical trial aiming at local dystrophin restoration following intramuscular injections of exon 46 and 51 specific AONs.

França - pesquisadores estudando camundongos com distrofia muscular conseguiram corrigir o gene da distrofina com o uso de oligonucleotídeos. Esta técnica "conserta" o gene da distrofina que passa a produzir uma proteína distrofina, incompleta ou defeituosa, mas capaz de reduzir os sintomas da doença. Os camundongos tratados com esta técnica expressaram a distrofina por muitos meses após a injeção dos oligonucleotídeos. Esta pesquisa foi comentada neste artigo:

Development of an Innovative Technique of Gene Therapy: Exon Skipping

USA - esta técnica utilizada em camundongos para tratar excesso de colesterol também poderia ser útil nas distrofias. Este texto eu copiei da Folha de São Paulo (texto de Ricardo Bonalume Neto):"uma das promessas da terapia genética ficou mais próxima das clínicas graças a um trabalho publicado na edição de hoje da revista científica britânica "Nature" (www.nature.com). Foi possível a uma equipe de 25 cientistas da Alemanha e dos Estados Unidos bloquear o funcionamento de um gene e baixar pela metade o colesterol em camundongos utilizando uma nova técnica, baseada na chamada interferência de RNA.
Genes defeituosos podem causar doenças ao orientar a fabricação de proteínas que fazem mal ao corpo. "Silenciar" esses genes é um objetivo que se conseguia obter razoavelmente em células em proveta, o chamado experimento in vitro. Mas era grande a dificuldade em exportar os resultados para dentro de um organismo vivo, o experimento in vivo.
A equipe liderada por Hans-Peter Vornlocher, da empresa farmacêutica Alnylam, da Alemanha, conseguiu criar uma técnica para fazer os pedacinhos de RNA "interferentes" chegarem aos tecidos e silenciarem os genes.
Ironicamente, a idéia era silenciar um gene que facilita o acúmulo de colesterol, e o meio para fazê-lo envolveu conjugar uma molécula de colesterol ao RNA.
Para entender a técnica é preciso lembrar o chamado "dogma central" da biologia molecular.
Para que a informação contida nos genes possa resultar na produção de uma proteína são necessárias duas etapas. A seqüência de DNA do gene é copiada na forma de mRNA (RNA mensageiro) no processo chamado transcrição. Depois, o mRNA se traduz em uma seqüência de proteína.
Um mecanismo natural chamado interferência de RNA (RNAi) pode bloquear a ação do gene. Os cientistas agora produziram sinteticamente pequenos pedaços de RNA capazes de silenciar o gene específico que queriam. Esse RNA sintético -siRNA- recebeu o colesterol, que facilitou a entrada do conjunto nos tecidos celulares. O siRNA grudou no RNA mensageiro e, com ajuda de proteína, cortou o mRNA ou impediu que ele se traduzisse em proteína.
"Avançamos significativamente na RNAi e achamos que podemos aplicar a técnica em humanos", disse Vornlocher ao jornal britânico "The Independent".
Os resultados foram considerados "encorajadores" por John Rossi, do Beckman Research Institute of the City of Hope, de Duarte, Califórnia (EUA), comentando a descoberta em um artigo da mesma revista "Nature". Para Rossi, porém, muitas questões ainda precisam ser respondidas antes de a técnica poder ser usada em seres humanos". A notícia em inglês pode ser lida aqui.

USA - pesquisadores obtiveram novas informações sobre a capacidade de regeneração dos músculos. Segundo esta pesquisa somente as células satélites próximas aos músculos seria capaz de promover a regeneração muscular. Estas células seriam superiores as células tronco adultas e as células da medula óssea.

Alemanha - a proliferação de mioblastos pode permitir a regeneração dos músculos em portadores de distrofia muscular; neste estudo realizado em laborátorio com células de portadores de Duchenne os pesquisadores conseguiram aumentar a proliferação de mioblastos com oligonucleotídeos e com a inibição de uma enzima utilizando a técnica do RNA de interferência (conforme descrito na notícia abaixo).

USA - algumas formas de distrofia muscular tipo cinturas e a distrofia de Miyoshi estão relacionadas a mutação do gene da disferlina. Neste estudo os pesquisadores estudaram um camundongo com mutação do gene da disferlina. Os pesquisadores realizaram o transplante de células de cordão umbilical nestes camundongos que receberam também drogas imunossupressoras durante todo o experimento. O estudo dos músculos permitiu identificar um pequeno número de células humanas implantadas nos músculos. Este estudo permitiu docimentar que as células do cordão umbilical humano tem um potencial de diferenciação em células musculares.

USA - neste estudo foram utilizados em camundongos com distrofia os  vetores virais com microgene da distrofina. Os animais jovens apresentaram melhora com a terapia gênica, o que não foi observado em camundongos mais velhos. Os músculo analisados apresentaram melhora nos camundongos mais jovens com maior expressão da distrofina.

(In Press: Molecular Therapy, 2004) Adeno-Associated Virus-Mediated Microdystrophin Expression Protects Young mdx Muscle from Contraction-Induced Injury

Mingju Liu, Yongping Yue, Scott Q. Harper, Robert W. Grange, Jeffrey S. Chamberlain, and Dongsheng Duan - USA

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is the most common inherited lethal muscle degenerative disease. Currently there is no cure. Highly abbreviated microdystrophin cDNAs were developed recently for adeno-associated virus (AAV)-mediated DMD gene therapy. Among these, a C-terminaltruncated DR4-R23/DC microgene (DR4/DC) has been considered as a very promising therapeutic candidate gene. In this study, we packaged a CMV.DR4/DC cassette in AAV-5 and evaluated the transduction and muscle contractile profiles in the extensor digitorum longus muscles of young (7- week-old) and adult (9-month-old) mdx mice. At ~3 months post-gene transfer, 50–60% of the total myofibers were transduced in young mdx muscle and the percentage of centrally nucleated myofibers was reduced from ~70% in untreated mdx muscle to ~22% in microdystrophin-treated muscle. Importantly, this level of transduction protected mdx muscle from eccentric contractioninduced damage. In contrast, adult mdx muscle was more resistant to AAV-5 transduction, as only ~30% of the myofibers were transduced at 3 months postinfection. This transduction yielded marginal protection against eccentric contraction-induced injury. The extent of central nucleation was also more difficult to reverse in adult mdx muscle (from ~83% in untreated to ~58% in treated). Finally, we determined that the DR4/DC microdystrophin did not significantly alter the expression pattern of the endogenous full-length dystrophin in normal muscle. Neither did it have any adverse effects on normal muscle morphology or contractility. Taken together, our results suggest that AAVmediated DR4/DC microdystrophin expression represents a promising approach to rescue muscular dystrophy in young mdx skeletal muscle.

São Paulo - pesquisa realizada na Universidade São Paulo demonstra que a creatina é capaz de reduzir a perda muscular quando administrada antes da imobilização e durante todo o experimento em camundongos. Os animais foram divididos em 3 grupos: os que não receberam a creatina apresentaram perda de 34% da massa muscular; os que receberam a creatina durante a imobilização tiveram perda de massa muscular semelhante; os que receberam creatina tiveram perda de 20% da massa muscular. Não foram relatados efeitos adversos nos animais.

O resumo do artigo em inglês segue a seguir:

(Clinicial Nutrition, 2004; 23:1176-1183) Deleteriuos effects of immobilization upon rat skeletal muscle: role of creatine supplementation  NEW

M.S. Aoki, W.P. Lima, E.H. Miyabara, C.H.A. Gouveia, A.S. Moriscot - Brazil

Summary Aim: The aim of the study was to investigate the impact of creatine feeding (5 g kg1 body weight day1) upon the deleterious adaptations in skeletal muscle induced by immobilization. Methods: Male Wistar rats were submitted to hind limb immobilization together with three dietary manipulations: control, supplemented with creatine for 7 days (along with immobilization) and supplemented with creatine for 14 days (7 days before immobilization and together with immobilization). Muscle weight (wet/dry) was determined in the soleus (SOL) and gastrocnemius (GAS). The analysis of lean mass was performed by DEXA and myosin heavy chain (MHC) distribution by SDSPAGE. Results: After 14 days of creatine loading, immobilized SOL and GAS total creatine content were increased by 25% and 18%, respectively. Regardless of dietary manipulation, the immobilization protocol induced a decrease in the weight of SOL and GAS (Po0.001). However, creatine feeding for 14 days minimized mass loss in the SOL and GAS (Po0.05). Our findings also indicate that creatine supplementation maximizes the expected slow-to-fast MHC shift driven by immobilization (Po0.05). Conclusions: Previous creatine supplementation attenuates muscle wasting induced by immobilization. This effect is associated with the increment of intramuscular creatine content.

França - na ausência de distrofina ocorre desestabilização da enzima oxido nítrico sintetase neuronal (nNOS) com prejuízo da função muscular. A proteína CAPON regula a distribuição da nNOS, e pode compensar a ausência da distrofina, resultado observado no parasita Caenorhabditis elegans. Esta proteína nunca tinha sido identifica em músculos de mamíferos. Neste estudo a proteína CAPON foi identificada em músculos de camundongos normais e nos músculos de camundongos com distrofia muscular. Há aumento do CAPON da 1a a 3a semana. CAPON aumenta no músculo após o tratamento com L-arginina*, substrato do NOS. Os níveis de CAPON e utrofina aumentam no músculo de camundongos tratados com deflazacort* e L-arginina, conhecidos tratamentos para retardar a evolução da distrofia. A identificação da CAPON poderá facilitar o entendimento do papelo do nNOS nas alterações musculares da distrofia muscular e pode auxiliar na identificação de novos tratamentos para retardar a evolução da distrofia.

* L-arginina é um dos componentes de um produto americano chamado de Juven que tem sido utilizado no tratamento de pacientes com distrofia muscular e o deflazacort é um tipo de corticóide que também é utilizado para retardar a evolução da distrofia muscular de Duchenne.

Japão - a lipofuccina é um pigmento que se acumula nas células em decorrência de oxidação de proteínas por radicais livres; é um marcardor de uma forma particular de agreção do músculo. Os autores descrevem a presença deste pigmento precocemente no músculo de pacientes com distrofia muscular de Duchenne e nos camundongos com distrofia muscular. Este achado identifica que a formação de radicais livre ocorre precocemente na distrofia muscular e pode ser um dos fatores de agressão do músculo na doença.

USA - a apoptose é um mecanismo programado de destruição das células; procurando estudar o papel na apoptose na destruição dos músculos na distrofia congênita os pesquisadores estudaram camundongos deficientes em Laminina alfa2; nestes animais os pesquisadores inativaram as proteínas que estimulam a apoptose; a inibição da apoptose aumentou significantemente a sobrevida dos camundongos, indicando que a pesquisa com drogas inibidoras da apoptose pode identificar alguma forma de tratamento para esta forma de distrofia.

USA - pesquisadores estudaram o uso das células tronco da medula óssea em um modelo experimental de distrofia tipo cinturas; em apenas duas amostras eles observaram a expressão da proteína em músculos da perna e em nenhuma amostra do músculo cardíaco.

Brasil - no dia 7 de dezembro os alunos da Faculdade de Medicina do ABC apresentarão em Washington, no Encontro Anual da Sociedade de Biologia Celular,  um poster com as informações sobre a pesquisa que realizaram com o tamoxifeno. Como já informamos anteriormente o tamoxifeno aumentou a força muscular de camundongos com distrofia muscular e diminuiu a degeneração muscular (este ainda em estudos preliminares). As informações que serão apresentadas poderão ser lidas aqui.

Japão - a gentamicina é um antibiótico que já foi testado em mutação de ponto na distrofia muscular de Duchenne; no entanto não são todos os pacientes com mutação de ponto que melhoram com a gentamicina. Neste estudo os autores descrevem um método simples para identificar os pacientes que melhoraram com o uso da gentamicina. Eles observaram que os pacientes que tinham a mutação tipo TGA no gene respondiam ao tratamento, enquanto os com mutação TAA ou TAG não. Quando este teste estiver disponível a gentamicina poderá ser testada na distrofia muscular de Duchenne.

(In Press: Brain & Development, 2004): A novel approach to identify Duchenne muscular dystrophy patients for aminoglycoside antibiotics therapy NEW

Shigemi Kimura, Kaori Ito, Toshihiko Miyagi, Takashi Hiranuma, Kowasi Yoshioka, Shirou Ozasa, Makoto Matsukura, Makoto Ikezawa, Masafumi Matsuo,Yasuhiro Takeshima, Teruhisa Miike  - Japan

Abstract

Aminoglycoside antibiotics have been found to suppress nonsense mutations located in the defective dystophin gene in mdx mice, suggesting a possible treatment for Duchenne muscular dystrophy (DMD). However, it is very difficult to find patients that are applicable for this therapy, because: (1) only 5-13% of DMD patients have nonsense mutations in the dystrophin gene, (2) it is challenging to find nonsense mutations in the gene because dystrophin cDNA is very long (14 kb), and (3) the efficiency of aminoglycoside-induced read-through is dependent on the kind of nonsense mutation. In order to develop a system for identifying candidates that qualify for aminoglycoside therapy, fibroblasts from nine DMD patients with nonsense mutation of dystrophin gene were isolated, induced to differentiate to myogenic lineage by AdMyoD, and exposed with gentamicin. The dystrophin expression in gentamicin-exposed myotubes was monitored by in vitro dystrophin staining and western blotting analysis. The results showed that gentamicin was able to induce dystrophin expression in the differentiated myotubes by the read-through of the nonsense mutation TGA in the gene; a read-through of the nonsense mutations TAA and TAG did not occur and consequently did not lead to dystrophin expression. Therefore, it is speculated that the aminoglycoside treatment is far more effective for DMD patients that have nonsense mutation TGA than for patients that have nonsense mutation TAA and TAG. In this study, we introduce an easy system to identify patients for this therapy and report for the first time, that dystrophin expression was detected in myotubes of DMD patients using gentamicin.

China - este grupo de pesquisa criou um vetor viral para utilização na terapia gênica de camundongos com distrofia muscular. Neste estudo os vírus foram injetados em artérias e promoveram expressão do gene nos músculos, prolongadamente. É mais uma evidência da possibilidade desta forma de terapia gênica para o tratamento da distrofia muscular humana.

http://www.pnas.org/cgi/content/abstract/0406700102v1?maxtoshow=&HITS=&hits=&RESULTFORMAT=1&andorexacttitle=and&andorexacttitleabs=and&fulltext=muscular+dystrophy&andorexactfulltext=and&searchid=1103384614512_7179&stored_search=&FIRSTINDEX=0&sortspec=date&fdate=12/1/2004&resourcetype=1

Inglaterra - este ano divulgamos vários artigos com o uso de oligoribonucleotídeos que atuariam "consertando" o gene defeituoso. Neste estudo o tratamento foi realizado em camundongos com injeções semanais de oligoribonucleotídeos associados a polímeros (não são os vetores virais utilizados em outros estudos). Houve expressão da distrofina nos músculos diafragma, gastrocnêmio, músculos intercostais mas não no coração. Este é mais um significativo avanço neste método de tratamento. O resumo do artigo em inglês que será publicado em breve está a seguir:

Systemic delivery of antisense oligoribonucleotide restores dystrophin expression in body-wide skeletal muscles

http://www.pnas.org/cgi/content/abstract/0406700102v1?maxtoshow=&HITS=&hits=&RESULTFORMAT=1&andorexacttitle=and&andorexacttitleabs=and&fulltext=muscular+dystrophy&andorexactfulltext=and&searchid=1103384614512_7179&stored_search=&FIRSTINDEX=0&sortspec=date&fdate=12/1/2004&resourcetype=1

Qi Long Lu, Adam Rabinowitz, Yun Chao Chen , Toshifumi Yokota, HaiFang Yin, Julia Alter, Atif Jadoon , George Bou-Gharios, and Terence Partridge - United Kingdom

Antisense oligonucleotide-mediated alternative splicing has great potential for treatment of Duchenne muscular dystrophy (DMD) caused by mutations within nonessential regions of the dystrophin gene. We have recently shown in the dystrophic mdx mouse that exon 23, bearing a nonsense mutation, can be skipped after intramuscular injection of a specific 2'-O-methyl phosphorothioate antisense oligoribonucleotide (2OMeAO). This skipping created a shortened, but in-frame, transcript that is translated to produce near-normal levels of dystrophin expression. This expression, in turn, led to improved muscle function. However, because DMD affects muscles body-wide, effective treatment requires dystrophin induction ideally in all muscles. Here, we show that systemic delivery of specific 2OMeAOs, together with the triblock copolymer F127, induced dystrophin expression in all skeletal muscles but not in cardiac muscle of the mdx dystrophic mice. The highest dystrophin expression was detected in diaphragm, gastrocnemius, and intercostal muscles. Large numbers of fibers with near-normal level of dystrophin were observed in focal areas. Three injections of 2OMeAOs at weekly intervals enhanced the levels of dystrophin. Dystrophin mRNA lacking the targeted exon 23 remained detectable 2 weeks after injection. No evidence of tissue damage was detected after 2OMeAO and F127 treatment either by serum analysis or histological examination of liver, kidney, lung, and muscles. The simplicity and safety of the antisense protocol provide a realistic prospect for treatment of the majority of DMD mutations. We conclude that a significant therapeutic effect may be achieved by further optimization in dose and regime of administration of antisense oligonucleotide.

USA - em 2001 este grupo de pesquisadores já tinha realizado uma pesquisa demonstrando os bons resultados utilizando a terapia gênica com a alfa 7 beta 1 integrina em camundongos. Eles utilizam camundongos sem distrofina e sem utrofina. Os resultados agora são mais completos e eles conseguem entender o que ocorreu com os camundongos; a estrutura da célula se mantem com este tratamento e há aumento das células satélites, responsáveis pela regeneração. Além disso ocorre retardo do aparecimento da lesão cardíaca nos camundongos; a terapia gênica com esta integrina inibe o desenvolvimento da lesão muscular e aumenta a sobrevida.

O estudo anterior deste grupo pode ser lido aqui. O vídeo do estudo anterior pode ser visto aqui.

Inglaterra - os autores fazem uma revisão sobre a função da miostatina, uma proteína da célula muscular responsável pela inibição do crescimento dos músculos. A sua inibição promove aumento da musculatura e pode ser uma boa opção para tratamento de diversas formas de distrofia. A inibição da miostatina promove aumento da massa muscular em camundongos com distrofia muscular. Ainda não há estudos em pacientes com distrofia mas no ano passado foi descrito o caso de um menino que nasceu com uma mutação do gene da miostatina; ele apresentava uma aumento bem significante da força muscular. Esta revisão será publicada em breve na Revista Neuromuscular Disorders e seu resumo em inglês pode ser lido abaixo:

(IN PRESS: Neuromuscular Disorders, 2005): The function of Myostatin and strategies of Myostatin blockade—new hope for therapies aimed at promoting growth of skeletal muscle - REVIEW  NEW

Ketan Patel, Helge Amthor - UK

Abstract

Genetic deletion of Myostatin, a member of the Transforming Growth Factor-beta family of signalling molecules, resulted in excessive growth of skeletal muscle. It demonstrated the remarkable intrinsic growth potential of skeletal muscle and led to the proposal that growth stimulation could amend diseased muscle without having to correct the primary cause of the disease. Furthermore, the presence of Myostatin in skeletal muscle in a number of muscle diseases and disease models suggested that it aggravated the primary pathology. Inhibition of Myostatin activity in mdx mouse, the animal model for Duchenne muscular dystrophy, resulted in increased force production and better tissue architecture which implicated Myostatin as a target for new therapeutic strategies. In this review we will discuss the phenotypes of animal models in which Myostatin function is altered. We will highlight the particularities of the Myostatin signalling pathway and describe molecular strategies that have been developed to inhibit the function of Myostatin on muscle. Finally, we will summarise the role of Myostatin in diseased muscle and discuss blockade of Myostatin as a potential therapy for muscular dystrophies.

França - no dia 7/01/2005 noticiamos uma pesquisa na qual o aumento da alfa 7B integrina diminuiu os sintomas da distrofia muscular em camundongos. Neste pesquisa com camundongos os animais foram tratados com L-arginina. Os animais apresentaram aumento da expressão da alfa 7 B integrina com este tratamento e o músculo diafragma apresentou redução das alterações degenerativas. Este pode ser um caminho para tratamento da doença até que um tratamento definitivo apareça. Este estudo será publicado em breve. O resumo, em inglês, pode ser lido abaixo:

(IN PRESS: FEBS Letters, 2005): α7B integrin changes in mdx mouse muscles after L-arginine administration

Delphine Chazalette, Karim Hnia, François Rivier, Gérald Hugon and Dominique Mornet - France

Abstract

Muscle fibers attach to laminin in the basal lamina using two mechanisms, i.e., dystrophin with its associated proteins and α7β1 integrin. In humans, gene-mutation defects in one member of these complexes result in muscular dystrophies. This study revealed changes after L-arginine treatment of utrophin-associated proteins and the α7B integrin subunit in mdx mouse, a dystrophin-deficient animal model. In the two studied muscles (cardiac muscle and diaphragm), the α7B integrin subunit was increased in 5-week-old treated mice. Interestingly, the diaphragm histopathological appearance was significantly improved by L-arginine administration. These results highlight a possible way to compensate for dystrophin deficiency via α7β1 integrin.

Itália - o gene da disferlina esta envolvido em uma forma de distrofia tipo cinturas e na miopatia de Miyoshi. Os estudos das biópsias musculares demonstram uma intensa atividade inflamatória/degenerativa dos músculos com ineficiência do sistema de regeneração.

Itália - a inflamação dos músculos contribui para a progressão da distrofia muscular de Duchenne. Neste estudo em camundongos os pesquisadores utilizaram uma droga imunossupressora, a ciclosporina A por 4 a 8 semanas. As alterações nas biópsias musculares foram significantemente menores nos animais tratados. As alterações funcionais e bioquímicas também foram menores nos animais tratados. Os resultados positivos com este estudo justificam o estudo desta droga em pacientes com distrofia muscular de Duchenne. Há um estudo clínico com a ciclosporina A na Alemanha.

USA - miostatina é uma proteína que inibe o crescimento muscular; alguns estudos tem demonstrado que o bloqueio ou eliminação da miostatina contribui para aumento da massa e da força muscular. Neste estudo com camundongos deficientes em laminina, uma forma grave de distrofia muscular em camundongos. A introdução do gene da miostatina não contribuiu para melhorar a força muscular e aumentou a mortalidade dos animais.

USA - a inibição da miostatina é uma maneira de aumentar a força muscular; neste trabalho os pesquisadores quiseram estudar os efeitos da ausência prolongada da miostatina, para saber se haveria algum efeito indesejável. Os camundongos velhos com distrofia e sem miostatina mantém a capacidade de regeneração, demonstrando que o bloqueio da miostatina pode ser uma alternativa viável para tratar a distrofia muscular.

Holanda - um dos entraves da terapia gênica é a escolha do melhor vetor viral para entrega do gene aos músculos. Este trabalho descreve um novo vetor para entrega do gene integral da distrofina aos músculos. O gene da distrofina é muito grande e este é uma dificuldade adicional para a terapia gênica. Este vetor foi testado em células e em camundongos. São estudos ainda bem iniciais. O resumo do artigo em inglês, que será publicado em março, pode ser lido abaixo:

(IN PRESS: Journal of Virology, March 2005, p. 3146-3162, Vol. 79, No. 5 ):Transfer of the Full-Length Dystrophin-Coding Sequence into Muscle Cells by a Dual High-Capacity Hybrid Viral Vector with Site-Specific Integration Ability NEW

Manuel A. F. V. Gonçalves, Gijsbert P. van Nierop,Marloes R. Tijssen, Pierre Lefesvre,Shoshan Knaän-Shanzer, Ietje van der Velde, Dirk W. van Bekkum,Dinko Valerio, and Antoine A. F. de Vries - The Netherlands

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is caused by mutations in the DMD gene, making it a potential target for gene therapy. There is, however, a scarcity of vectors that can accommodate the 14-kb DMD cDNA and permanently genetically correct muscle tissue in vivo or proliferating myogenic progenitors in vitro for use in autologous transplantation. Here, a dual high-capacity adenovirus-adeno-associated virus (hcAd/AAV) vector with two full-length human dystrophin-coding sequences flanked by AAV integration-enhancing elements is presented. These vectors are generated from input linear monomeric DNA molecules consisting of the Ad origin of replication and packaging signal followed by the recently identified AAV DNA integration efficiency element (p5IEE), the transgene(s) of interest, and the AAV inverted terminal repeat (ITR). After infection of producer cells with a helper Ad vector, the Ad DNA replication machinery, in concert with the AAV ITR-dependent dimerization, leads to the assembly of vector genomes with a tail-to-tail configuration that are efficiently amplified and packaged into Ad capsids. These dual hcAd/AAV hybrid vectors were used to express the dystrophin-coding sequence in rat cardiomyocytes in vitro and to restore dystrophin synthesis in the muscle tissues of mdx mice in vivo. Introduction into human cells of chimeric genomes, which contain a structure reminiscent of AAV proviral DNA, resulted in AAV Rep-dependent targeted DNA integration into the AAVS1 locus on chromosome 19. Dual hcAd/AAV hybrid vectors may thus be particularly useful to develop safe treatment modalities for diseases such as DMD that rely on efficient transfer and stable expression of large genes.

USA -  este congresso se realizará em Miami, em abril de 2005. É o mais importante encontro de neurologistas. Eu selecionei todos os resumos com temas em distrofia muscular. Os mais importantes estão relacionados com a droga PTC 124, que começou a ser testada em seres humanos para tratamento da mutação de ponto da distrofia muscular de Duchenne. Outro artigo inovador fala do uso de corticóides em mulheres portadoras do gene da distrofia muscular, com resultados positivos na melhora da fraqueza muscular progressiva. Outro artigo fala do efeito positivo do  uso da mexelitina para controle da miotonia na distrofia miotônica e o outro relata que a droga modafinil não melhora a sonolência diurna nesta forma de distrofia. Os resumos em inglês de todos os trabalhos pode ser lido aqui.

Inglaterra - os corticóides retardam a progressão da distrofia muscular de Duchenne por mecanismo ainda incerto.Nesta pesquisa os autores estudaram os mediadores que podem acarretar degeneração dos músculos de camundongos com distrofia muscular.Vários destes mediadores estão alterados com a distrofia. O tratamento com corticóides reduz a degeneração muscular por modificações complexas dos músculos. É mais um trabalho demonstrando o efeito benéfico dos corticóides.

http://hmg.oupjournals.org/cgi/content/abstract/14/6/775?maxtoshow=&HITS=&hits=&RESULTFORMAT=1&andorexacttitle=and&andorexacttitleabs=and&fulltext=muscular+dystrophy&andorexactfulltext=and&searchid=1110060198341_13988&stored_search=&FIRSTINDEX=0&sortspec=date&fdate=2/1/2005&resourcetype=1

Japão -  a ausência do alfa sarcoglican causa uma forma de distrofia tipo cinturas. Neste estudo os autores avaliaram o efeito do - sarcoglican em camundongos com distrofia muscular tipo cinturas. A superexpressão do - sarcoglican  em camundongos normais não causou nenhum efeito deletério. Em camundongos com deficiência de alfa sarcoglican a superexpressão do - sarcoglican causou melhora dos danos musculares da doença, constituindo-se num alternativa promissora para o tratamento da doença.

USA e Japão - os pesquisadores ainda não conseguiram decidir qual o melhor método para levar o gene da distrofia a todos os músculos. Por isto muitas pesquisas são feitas para observar os resultados de diferentes vírus em animais. Esta semana dois artigos mostram sucesso com o uso de dois vetores virais diferentes para utilização em terapia gênica. Os artigos são os seguintes:

Stable transduction of myogenic cells with lentiviral vectors expressing a minidystrophin

Effective repetitive dystrophin gene transfer into skeletal muscle of adult mdx mice using a helper-dependent adenovirus vector expressing the coxsackievirus and adenovirus receptor (CAR) and dystrophin

Esta falta de um consenso sobre o melhor vírus faz com que novas pesquisas sejam feitas e retardam o início de estudo em seres humanos.

Inglaterra - beta endorfinas são substâncias presentes no organismo e responsáveis pelo controle da dor e outras funções, com ações semelhantes aos medicamentos opióides como a morfina. A utilização das beta endorfinas em camundongos normais e com distrofia causou redução da fadiga além do aumento da captação da glicose pelo músculo. As beta endorfinas e as drogas que atuam como elas estão sendo estudadas para tratamento de doenças musculares acompanhadas de fadiga.

USA - o bloqueio da miostatina pode ser uma estratégia para tratamento da distrofia muscular de Duchenne. A utilização de um propeptídeo para bloquear a miostatina foi testada em camundongos com distrofia muscular. O resultado demonstrou que este tratamento reduz as alterações dos músculos e aumenta a força muscular, confirmando o potencial deste tratamento na distrofia muscular. O resumo deste artigo em inglês está a seguir:

(IN PRESS: The FASEB Journal. 2005;19:543-549) Myostatin propeptide-mediated amelioration of dystrophic pathophysiology

Sasha Bogdanovich, Kelly J. Perkins, Thomas O. B. Krag, Lisa-Anne Whittemore  and Tejvir S. Khurana - USA

Mutations in myostatin (GDF8) cause marked increases in muscle mass, suggesting that this transforming growth factor-ß (TGF-ß) superfamily member negatively regulates muscle growth. Myostatin blockade therefore offers a strategy for reversing muscle wasting in Duchenne’s muscular dystrophy  (DMD) without resorting to genetic manipulation. Here, we demonstrate that pharmacological blockade using a myostatin propeptide stabilized by fusion to IgG-Fc improved pathophysiology of the mdx mouse model of DMD. Functional benefits evidenced by specific force improvement, exceeded those reported previously using myostatin antibody-mediated blockade. More importantly, use of a propeptide blockade strategy obviates possibilities of anti-idiotypic responses that could potentially limit the effectiveness of antibody-mediated myostatin blockade strategies over time. This study provides a novel pharmacological strategy for treatment of diseases associated with muscle wasting such as DMD and since it uses an endogenous inhibitor of myostatin should help circumvent technical hurdles and toxicity associated with conventional gene or cell based therapies.  

Australia - a interleucina 15 já tinha demonstrado a capacidade de aumentar a força muscular em ratos com câncer. O uso da interleucina 15 por 4 semanas em camundongos com distrofia muscular reduziu as alterações do músculo diafragma e causou  aumento da força deste músculo. Considerando que a falência respiratória é uma das complicações mais graves da distrofia muscular de Duchenne este tratamento, se comprovado em humanos, pode contribuir para retardar a evolução da doença.

Japan - um  dos problemas da terapia gênica é a escolha do vetor para levar o gene até o músculo e como adminstrar este tratamento. O Dr. Matsuo estuda há muito tempo uma técnica de correção do gene da distrofina, com oligonucleotídeos. Neste estudo em camundongos ele injetou os oligonucleotídeos por via peritoneal, sem estar ligado a nenhum vetor viral. Ele conseguiu demonstrar que após 2 dias e até por 14 dias houve expressão da distrofina nos músculos demonstrando que é possível corrigir o gene por via sistêmica e sem utilizar nenhum vetor viral. O resumo deste artigo, que será publicado em breve, pode ser lido abaixo:

(IN PRESS: Brain e Development, 2005) Intraperitoneal administration of phosphorothioate antisense oligodeoxynucleotide against splicing enhancer sequence induced exon skipping in dystrophin mRNA expressed in mdx skeletal muscle

Yasuhiro Takeshima, Mariko Yagi,  Hiroko Wada, Masafumi Matsuo - Japan

Abstract

Antisense oligodeoxynucleotide against the splicing enhancer sequence (SES) in exon 19 of the dystrophin gene have been shown to induce exon 19 skipping and promote the expression of internally deleted dystrophin by correcting the translational reading frame in the cultured Duchenne muscular dystrophy (DMD) myocytes with the deletion of exon 20. Transfection of the antisense oligodeoxynucleotide, therefore, has been proposed as a promising means for therapeutic modification of dystrophin mRNA of DMD, a fatal disorder caused by defects in the dystrophin gene. A systemic delivery method targeting the large number of diseased muscles remains to be established for clinical application of antisense oligodeoxynucleotide. In this study, we investigated capability of oligodeoxynucleotide transfer into the skeletal muscles of mdx mouse, a mouse model of DMD. Thirty-one mer phosphorothioate oligodeoxynucleotide complementary to the SES of dystrophin exon 19 was intraperitoneally administered to mdx mice without any carrier. Histochemical study disclosed that fluorescencelabeled oligodeoxynucleotide appeared in the nuclei of femoral skeletal muscle cell at the second day after injection of 20 mg/kg BW oligodeoxynucleotide, and still visible at 14th day. Reverse transcription (RT)-PCR analysis of dystrophin transcript in these cells disclosed that a proportion of it showed skipping of exon 19 from second to seventh day after injection. These results showed that the intraperitoneally administered oligodeoxynucleotide could be transfected to nucleus of mdx skeletal muscle without any carrier and was able to induce exon skipping in vivo.

Brasil - o dinitrato de isosorbitol é utilizado há muitos anos no tratamento das doenças coronárias; a droga é um doador de óxido nítrico, que está implicado na regeneração muscular; seu mecanismo de ação é muito semelhante a droga Viagra, utilizada em disfunção erétil. Neste trabalho os pesquisadores causaram uma lesão muscular nos camundongos com distrofia muscular e analisaram a regeneração dos músculos, com e sem medicação, comparando-se os efeitos com outras drogas como o verapamil (que é um vasodiltador). Os resultados demonstraram que o dinitrato de isosorbitol aumenta a regeneração dos músculos de camundongos com distrofia muscular, abrindo uma nova porta para drogas que podem ser úteis para retardar a evolução da distrofia muscular. O resumo em inglês está a seguir:

(IN PRESS: Neuroscience Letters 2005) Muscle regeneration in dystrophic mdx mice is enhanced by isosorbide dinitrate

Maria Julia Marques, Marcus Alexandre Mendes Luz, Elaine Minatel, Humberto Santo Neto - Brazil

Abstract

Activation of muscle satellite cells, a fundamental step in the success of muscle regeneration is mediated by nitric oxide (NO). In this study, we investigated whether isosorbide dinitrate (ISD), an NO donor, could improve muscle regeneration in dystrophic mdx mice. The right tibialis anterior muscle of mdx and C57Bl/10 mice was injected with bupivacaine (0.3 ml, 33 mg/kg), a myotoxic agent, to induce muscle fiber regeneration. After bupivacaine injection, mice were treated with ISD (30 mg/kg; i.p.), verapamil (a non-NO donor vasodilator, 15 mg/kg, i.p.) or saline solution (vehicle, 0.3 ml, i.p.) for 20 days. Some bupivacaine-injected mice received no pharmacological treatment (control group). Muscle regeneration was evaluated by counting the total number of muscle fibers and measuring myofiber cross-sectional area. ISD significantly improved bupivacaine-induced muscle regeneration in mdx by increasing by 20% the total number of muscle fibers compared to the other groups. Spontaneous muscle regeneration, evaluated in the contralateral non-injected muscle, was not affected. ISD treatment did not affect myofiber cross-sectional area. Verapamil and saline had no effect on muscle regeneration. These results suggested that NO derived from ISD stimulated and/or recruited satellite cells. Pharmacological treatment with ISD could be clinically useful for improving muscle regeneration in Duchenne muscular dystrophy.

 

Holanda - grupo de especialistas se reuniram na Holanda para discutir os protocolos existentes para tratamento da distrofia muscular com oligonucleotídeos, uma maneira de corrigir a doença, ou amenizar os sintomas. A propósito desta reunião a revista Neuromuscular Disorders publicou um editorial sobre o tema. As conclusões do editorial podem ser lidas abaixo, mas as mais  importantes informações deste editorial são:

a) o uso de oligonuleotídeos não pode ser considerado como uma forma de terapia gênica;

b) os oligonulceotídeos podem fazer a celula produzir a distrofina, mas o defeito genético continuará;

c) não se sabe por quanto tempo este tratamento irá funcionar e se deverá ser repetido muitas vezes;

d) pesquisas serão necessárias para decidir qual o melhor método de levar os oligonucleotideos para os músculos;

e) este tratamento visa amenizar os sintomas da doença, ou seja transformar uma distrofia de Duchenne em Becker;

f) os pesquisadores alertam que muitos anos serão necessários para que este tratamento esteja definitivamente estabelecido.

(IN PRESS: Neuromuscular Disorders, 2005) Editorial - Antisense oligonucleotides (AO) in the treatment of Duchenne muscular dystrophy: Where are we now?

Concluding comments

Finally, it should be noted that this antisense oligonucleotide induced exon skipping strategy should not be considered as a form of gene therapy. While the effects do occur in the nucleus, as the dystrophin gene is being actively transcribed and processed, no permanent genetic changes are induced. In contrast to the introduction of entire transgenes in plasmid or viral vectors, AOs should be regarded as ‘informational drugs’ [24], which do not encode a complete product. The site of action for AO induced exon skipping is the primary gene transcript, not the gene. Once the AO has been degraded, metabolised or cleared from the nucleus and cell, its biological activity will dissipate. In many respects, it would be difficult to ‘reverse engineer’ a system with a gene transcript better suited for targeted exon skipping than the dystrophin pre-mRNA. Major regions of the dystrophin protein-coding region can be omitted with minor losses in function, as demonstrated by mildly affected or asymptomatic Becker MD patients. The half-life of the protein is several weeks and there should be a slow turn-over of the muscle fibres if the induced protein does restore strength and stability to the muscle. Induced exon skipping would not be readily applicable to small gene transcripts where all exons are essential for function, or if the gene transcript has a short biological halflife. Similarly, the AOs would not be very effective in cells that divide rapidly, thereby diluting any AO taken up into the nucleus to sub-therapeutic levels. In the event that AOs induce very efficient exon skipping in the early trials, the issue of systemic AO delivery must be addressed and it may conceivably take years to demonstrate clinical benefits to the patients. It will be a frustratingly slow process and this will cause major concerns to parents, patients, clinicians, and the researchers. It is essential that the trials be undertaken transparently and meticulously to ensure no harm to the participants and that any reported benefits are reproducible. Exon skipping will not provide a cure for DMD and will only be effective in a subset of patients. Treatment and care has improved the quality and life expectancy of DMD patients. It may be anticipated that the restoration of some dystrophin by targeted exon skipping will provide additional benefit, the extent of which remains to be determined.

USA - nos músculo existem células com capacidade semelhante as células tronco; neste estudo  estas células forma injetadas em camundongos com distrofia muscular. O tratamento levou a formação de células híbridas, com características dos músculos esqueléticos e dos músculos cardíacos. Este estuda demonstra que estas células, após novos estudos experimentais, possam ser utilizadas no tratamento da disfunção cardíaca da distrofia muscular de Duchenne.

USA - a coenzima Q10 tem sido estudada em distrofia muscular para retardar a evolução da doença; os estudos clínicos com a droga ainda não foram concluídos. No entanto neste trabalho os autores estudando os níveis de coenzima Q10 no músculo observaram que na distrofia muscular eles estavam mais baixos do que em outras doenças musculares; os níveis baixos desta coenzima também estavam relacionados com stress oxidativo. Este estudo sugere que o uso da coenzima Q10 possa ter algum efeito benéfico na distrofia muscular. O artigo pode ser lido, em inglês, abaixo:

Muscle Coenzyme Q: A Potential Test for Mitochondrial Activity and Redox Status

Lili Miles, Michael V. Miles PharmD, Peter H. Tang, Paul S. Horn PhD, Brenda L. Wong MD, Ton J. DeGrauw MD, Paula J. Morehart RN and Kevin E. Bove MD - Ohio

The aim of this study is to determine whether coenzyme Q (CoQ) muscle concentrations and redox state are associated with pathologic changes in muscle biopsy specimens. Skeletal muscle biopsies were collected (January 2002-February 2004) and underwent pathologic evaluation. Quadriceps specimens (n = 47) were stratified accordingly: Group 1, controls without evidence of pathologic abnormalities; Group 2, type I myofiber predominance; Group 3, type II myofiber atrophy; Group 4, lower motor unit disease; and Group 5, muscular dystrophy Ubiquinol-10, ubiquinone-10, total coenzyme Q10 (CoQ10), coenzyme Q9 (CoQ9), total CoQ (CoQ9+CoQ10) concentrations were analyzed in biopsy muscle by high-performance liquid chromatography. Ubiquinone-10, total CoQ10, and total CoQ concentrations were significantly decreased in Group 5. Significant positive correlations (r congruent with 0.40) were found between muscle ubiquinone-10, total CoQ10, and total CoQ concentrations vs the percentage of myofibers having subsarcolemmal mitochondrial aggregates. CoQ redox ratio and the fraction CoQ9/total CoQ were negatively correlated with subsarcolemmal mitochondrial aggregates. A significant correlation (r = 0.328) also occurred between ubiquinol-10 concentration and citrate synthase activity. This study suggests that total CoQ concentration provides a new method for estimating mitochondrial activity in biopsy muscle; and that the muscle CoQ test is feasible and potentially useful for diagnosing CoQ deficiency states
 

Inglaterra -  os pesquisadores desenvolveram um camundongo transgênico que apresenta uma doença semelhante a distrofia óculo-faríngea; esta doença progressiva se inicia na 5a a 6a  década e se caracteriza por dificuldade a deglutição, ptose palpebral e fraqueza muscular proximal dos braços. Neste camundongo o uso de doxiciclina, um antibiótico utilizado a muito tempo, promove retardo e atenuação dos sintomas e pode se constituir em uma alternativa de tratamento.

USA -  neste encontro que realizar-se-á em julho, de 1 a 5, serão apresentados 29 artigos sobre terapia gênica em distrofia muscular. A maioria das pesquisas é americana (12), seguida do Canadá (7) e França e Japão (4 cada). A grande maioria é experimental (cães e camundongos) e algumas são realizadas em células musculares humanas ou estudam a terapia gênica em um único músculo. Apesar de promissoras não há nenhuma pesquisa em andamento que permita a sua utilização.

USA - o uso de um vírus contendo uma parte do gene da distrofina tem sido experimentado em camundongos; com este tratamento há redução da agressão do músculo e aumento da força muscular, sem que se obtenha a melhora total da doença. Neste estudo os autores estudaram a terapia gênica em camundongos usando um vetor viral com dois genes: o da IGF-1 e o microgene da distrofina. A utilização dos dois genes causou aumento da massa e da força muscular, com redução do grau de degenerção muscular. Portanto esta alternativa pode ser considerada mais eficiente para o tratamento da distrofia muscular. O resumo em inglês do artigo pode ser lido abaixo:

(IN PRESS: Molecular Therapy,2005) Phenotypic Improvement of Dystrophic Muscles by rAAV/Microdystrophin Vectors Is Augmented by Igf1 CodeliveryB

Simone Abmayr, Paul Gregorevic, James M. Allen and Jeffrey S. Chamberlain - USA

The absence of dystrophin in Duchenne muscular dystrophy (DMD) leads to sarcolemmal instability and enhances the susceptibility of muscle fibers to contraction-induced injury. Various viral vectors have been used to deliver mini- and microdystrophin expression cassettes to muscles of dystrophin deficient mdx mice, significantly increasing both the morphological and the functional properties of the muscles. However, dystrophin delivery to adult mdx mice has not yielded a complete rescue of the dystrophic phenotype. Here we investigated a novel strategy involving dual gene transfer of recombinant adeno-associated viral vectors expressing either microdystrophin (rAAV-MDys) or a muscle-specific isoform of Igf-1 (rAAV-mIgf-1). Injection of mdx muscles with rAAV-MDys reduced myofiber degeneration and turnover and increased their resistance to mechanical injury, but did not increase muscle mass or force generation. Injection of mdx muscles with rAAV-mIgf-1 led to increased muscle mass, but did not provide protection against mechanical injury or halt myofiber degeneration, leading to loss of the vector over time. In contrast, co-injection of the rAAV-MDys and rAAV-mIgf-1 vectors resulted in increased muscle mass and strength, reduced myofiber degeneration, and increased protection against contraction-induced injury. These results suggest that a dual-gene, combinatorial strategy could enhance the efficacy of gene therapy of DMD.

Coréia - "Clonagem terapêutica potencializa a produção das células-tronco
Gina Kolata escreve para ‘The New York Times’:
Pesquisadores sul-coreanos anunciam nesta sexta-feira que desenvolveram uma receita altamente eficiente para produção de embriões humanos por clonagem, para posterior extração de suas células-tronco. Escrevendo na revista ‘Science’, os pesquisadores, liderados pelo dr. Woo Suk-Hwang e pelo dr. Shin Yong-Moon da Universidade Nacional de Seul, disseram que usaram seu método para produzir 11 linhagens de células-tronco humanas geneticamente iguais às de pacientes cujas idades variavam de 2 até 56 anos.O método, chamado clonagem terapêutica, é uma das grandes esperanças do campo da célula-tronco. Ela produz células-tronco, células universais que são extraídas de embriões, matando os embriões no processo, e que, na teoria, podem ser orientadas a se desenvolverem em qualquer tipo de célula do corpo.Como as células-tronco vêm de embriões que são clones dos indivíduos, a combinação genética delas é exata. Os cientistas querem obter tais células-tronco de pacientes com certas desordens e males para estudar a origem das doenças e desenvolver células substitutas que seriam idênticas àquelas que o paciente perdeu em uma doença como o mal de Parkinson. Hwang disse que não tem intenção de usar o método para produzir bebês que sejam clones. ‘Nossa proposta se limita a encontrar uma forma de curar doenças’, disse ele. ‘Esta é nossa proposta e nossa meta de pesquisa.’ Previamente, o mesmo grupo produziu uma única linhagem de células-tronco de um embrião clonado, mas o processo foi tão oneroso que muitos cientistas disseram que não valia a pena repeti-lo, e alguns duvidaram que o trabalho dos sul-coreanos estava até mesmo correto.
Mas as coisas mudaram.
A nova descoberta animou os pesquisadores que queriam usar tais células-tronco para estudar doenças, mas que achavam que ainda seriam necessários anos, quanto muito, antes de se tornar prático obtê-las.‘É um tremendo avanço’, disse o dr. Leonard Zon, pesquisador de células-tronco da Escola de Medicina de Harvard e presidente da Sociedade Internacional para Pesquisa de Células-Tronco, que não esteve envolvido na pesquisa.Mas o relatório gerou preocupações entre outros, que disseram que foi um passo ladeira perigosa abaixo que leva à clonagem de bebês. Richard Doerflinger, diretor de atividades pró-vida da Conferência dos Bispos Católicos dos EUA, disse:‘Até agora, as pessoas estavam começando a se perguntar se a clonagem humana para algum propósito era viável. Este desenvolvimento a torna viável o suficiente para se tornar um perigo real e imediato’. O estudo coreano influenciará o delicado debate político em torno da pesquisa de célula-tronco embrionária, que está em andamento no Capitólio (Parlamento dos EUA).A Câmara deverá votar já no início da próxima semana uma medida que expandirá o financiamento federal para estudos de células-tronco embrionárias. A medida, que tem provocado profundas divisões entre os republicanos, não aborda a clonagem terapêutica. Mas um segundo projeto de lei, apresentado pelo senador Orrin Hatch, republicano de Utah, permitiria aos contribuintes financiar estudos de clonagem terapêutica, ao mesmo tempo em que proíbe a clonagem para reprodução. Em seu trabalho, os pesquisadores sul-coreanos produziram células-tronco que são cópias perfeitas para 9 entre 11 pacientes, incluindo oito adultos com lesões na medula espinhal e três crianças – um menino de 10 anos com lesão na medula espinhal, uma menina de 6 anos com diabete, e um menino de 2 anos com hipogamaglobulinemia congênita, uma desordem genética do sistema imunológico.  Zon alertou que ‘será necessário muito trabalho’ antes que as células-tronco possam cumprir suas promessas na medicina, mas ele disse que os novos resultados deixarão os cientistas significativamente mais próximos de suas metas.‘Será a ponta de lança do esforço, sem dúvida’, disse Zon.  Hwang disse que foi soterrado por pedidos de pesquisadores que desejam visitar e estudar seus métodos, incluindo o dr. Ian Wilmut, o pesquisador na Escócia que criou o primeiro mamífero clonado, uma ovelha chamada Dolly, em 1996, que deixou os cientistas atônitos, pois achavam que a clonagem era biologicamente impossível. Wilmut visitou o laboratório em Seul, e nesta semana Hwang foi até o laboratório de Wilmut no Instituto Roslin, em Edimburgo, para ajudá-lo em sua busca para produzir embriões humanos por clonagem para extração de suas células-tronco. Outros também estão tentando. Na Inglaterra, o Centro Internacional para a Vida, em Newcastle upon Tyne, anunciou que produziu um embrião humano por clonagem, apesar de não ter dito se extraiu suas células-tronco ou se passaram pelos muitos passos detalhados para provar que eram células-tronco e que eram de um clone, como fizeram os sul-coreanos. Até agora, os cientistas vinham estudando as células-tronco embrionárias humanas extraindo-as de embriões criados para tal propósito. Isto não envolvia a clonagem de células de pacientes específicos. Elas também obtiveram células-tronco de embriões criados em clínicas de fertilidade e doados pelos casais que não mais precisavam deles. Além disso, os cientistas estão estudando células-tronco de ratos, trabalhando na difícil tarefa de dirigir o desenvolvimento das células em tipos específicos de tecido. Mas os pesquisadores queriam embriões que fossem pares genéticos dos pacientes. A única forma de fazer isto seria usando embriões que fossem clones dos pacientes, e a clonagem humana parecia praticamente impossível. Para produzir um clone, os cientistas inserem o material genético de uma célula do paciente em um óvulo não fertilizado de outra pessoa, cujo material genético foi removido. Os genes da célula do paciente assumem o controle, direcionando o óvulo para se dividir e se transformar em um embrião que é geneticamente idêntico ao paciente, em vez da doadora do óvulo.  Cerca de cinco dias depois, quando o embrião clonado contém cerca de 100 células e possui cerca de 0,08 polegada de diâmetro, ele muda sua forma, parecendo uma bola de células envoltas em uma esfera. Tal bola de células, quando removida e cultivada no laboratório, se transforma nas células-tronco embrionárias.Mas tal processo fracassa mais do que é bem-sucedido e, nos seres humanos, parece fracassar todas as vezes. Em seu relatório anterior, publicado em fevereiro passado, Hwang e Moon usaram 248 óvulos humanos para produzir uma única linhagem de células-tronco embrionárias – um grupo de células que vem de uma célula embrionária e que pode ser cultivado em laboratório em placas de Petri. Mas desta vez, com um punhado de avanços técnicos que envolveram em grande parte métodos de crescimento de células e abertura de embriões, eles usaram em média 17 óvulos por linhagem de célula-tronco e podiam quase garantir o sucesso com os óvulos de apenas uma mulher, obtidos em um único mês. Não importava se o paciente cujas células estavam sendo clonadas era jovem ou de meia-idade, do sexo masculino ou feminino, doente ou saudável – o processo funcionava. ‘Você quase não tem motivos para não fazê-lo’, disse o dr. Davor Solter, diretor do Instituto Max Planck de Imunobiologia, em Freiberg, Alemanha. Solter acrescentou que parece mais eficiente clonar e obter células-tronco humanas do que fazer a mesma experiência em animais, apesar de ninguém saber por quê. Sete Estados proíbem qualquer tipo de clonagem humana, e 11 possuem leis que impedem a pesquisa de célula-tronco embrionária, disse Lori B. Andrews, uma professora de Direito da Faculdade Chicago-Kent de Direito. Recursos federais se restringem ao uso de linhagens de células-tronco aprovadas pelo governo Bush em 2001. Mas onde tal trabalho é legal, um número crescente de cientistas, incluindo Zon, diz contar com financiamento privado e que planeja seguir em frente usando a clonagem para produzir células-tronco.O dr. John Gearhart, um pesquisador de célula-tronco da Universidade Johns Hopkins, disse que o novo trabalho fornecerá o impulso. ‘Eu acho que veremos mais pessoas no jogo’, disse ele.
Mas nem todos estão empolgados.
O dr. Leon Kass, presidente do Conselho de Bioética do Presidente, comentou em uma mensagem por e-mail que ‘seja qual for seu mérito técnico, esta pesquisa é moralmente perturbadora: ela cria embriões humanos apenas para pesquisa, facilita muito a produção de bebês clonados e explora as mulheres como doadoras de óvulos sem que seja para seu benefício’.O governo sul-coreano, que pagou pelo novo estudo, transformou em ofensa criminal o implante de um embrião clonado no útero de uma mulher, disse Hwang. ‘Isto deve ser banido em todo o mundo’, ele acrescentou. Os participantes do estudo sul-coreano queriam apenas o avanço da medicina, disse Hwang. Entre eles estavam 18 mulheres que forneceram óvulos, incluindo uma das pacientes do estudo que forneceu seus próprios óvulos. Os cientistas sul-coreanos trabalharam arduamente, disse o dr. Gerald Schatten, da Escola de Medicina da Universidade de Pittsburgh, que visitou o laboratório deles e ajudou os cientistas, cujo inglês é limitado, a escrever o relatório. ‘Eles trabalharam 365 dias por ano, exceto no ano bissexto, no qual que trabalharam 366 dias’, disse Schatten. ‘Eles realizavam reuniões de laboratório às 6h30 toda manhã exceto aos domingos, quando as realizavam às 8h.’ Poucos se aventurariam na arena da clonagem caso a ciência não fosse muito promissora, disseram os pesquisadores. É claro, disseram os pesquisadores, ainda resta muito a fazer para transformar as células-tronco em terapias. ‘Será necessário muito trabalho’, disse o dr. Ronald McKay, um pesquisador de células-tronco dos Institutos Nacionais de Saúde.‘Mas nós queremos que isto funcione -não é uma teoria. Meu julgamento técnico e profissional me diz que isto é realmente importante.’Mas Kass disse que a clonagem e extração de células-tronco de embriões não é a única forma de realizar tal trabalho. Ele disse que a maioria do Conselho de Bioética do Presidente pediu uma moratória da clonagem para pesquisa, e disse que o conselho sugeriu recentemente outras formas de obtenção de células-tronco capazes de serem desenvolvidas nos tipos de tecidos desejados e que combinariam com as próprias células do paciente, ‘sem estas violações e riscos morais’.As pesquisas de opinião apresentam resultados variados, freqüentemente dependendo das palavras que são usadas para descrever o trabalho. Em uma recente pesquisa Gallup, apenas 38% dos pesquisados aprovaram a clonagem de embriões para pesquisa. Outra pesquisa, que usou o termo ‘transferência nuclear da célula somática’ em vez de ‘clonagem’ apresentou 72% de aprovação. O trabalho de Hwang vai um passo além, usando ‘TNCS’ em vez de ‘transferência nuclear da célula somática’. A dra. Ruth Faden, diretora executiva do centro de bioética da Johns Hopkins, disse que o debate moral mudará caso as pesquisas de células-tronco levem a novos tratamentos com benefícios dramáticos para alguns pacientes. ‘Isto poderia realmente sacudir as coisas’, disse ela.Mas o dr. Richard Land, presidente da comissão de ética e liberdade religiosa da Convenção Batista do Sul, disse que seu grupo não será persuadido. ‘Nós acreditamos que um embrião clonado é um ser humano’, disse ele. ‘Nós não devemos ser o tipo de sociedade que mata nossos menores seres humanos para buscar tratamento para seres humanos maiores e mais velhos.’ (Colaborou Sheryl Gay Stolberg, com reportagem, em Washington.) (Tradução: George El Khouri Andolfato) (The New York Times, Uol.com/Mídia Global, 20/5)

USA -  a doença cardíaca é uma das complicações mais frequentes na distrofia muscular de Duchenne; neste estudo os autores procuram avaliar se o aumento do óxido nítrico pode alterar a evolução da doença cardíaca em camundongos. Utilizando camundongos com deficiência em distrofina e com superexpressão de óxido nítrico sintetase os pesquisadores demonstraram redução das manifestações cardíacas, o que pode demonstrar que  o aumento do óxido nítrico pode ser uma opção no futuro para retardar a evolução da doença cardíaca na distrofia muscular.

http://ajp.amjpathol.org/cgi/content/abstract/166/6/1741?maxtoshow=&HITS=&hits=&RESULTFORMAT=1&andorexacttitle=and&andorexacttitleabs=and&fulltext=muscular+dystrophy&andorexactfulltext=and&searchid=1117318464465_11536&stored_search=&FIRSTINDEX=0&sortspec=date&fdate=5/1/2005&resourcetype=1

França - um dos problemas da terapia gênica na distrofia muscular  é levar o gene até os músculos e fazer este gene funcionar. Nesta pesquisa os autores utilizaram o gene da distrofia acompanhado de um gene fluorescente em camundongos com distrofia muscular. Apesar de conseguir demonstrar que as células ficaram fluorescentes os músculos não expressaram a distrofina em quantidade significante.

Inglaterra - pesquisadores transferiram um gene denominado MGF (mecano fator de crescimento) em camundongos com distrofia muscular e observaram importante aumento da força muscular da ordem de 35 a 40% em 3 semanas. Esta terapia pode ser útil em várias formas de distrofia e em outras doenças que se acompanham de perda de força muscular (câncer, AIDS, senelidade,etc). Não há referências a complicações com este tratamento e os autores pretendem iniciar estudos clínicos em breve. 

Japão -  camundongos com distrofia muscular submetidos a exercícios físicos tem redução de sua capacidade de regeneração. Os autores deste estudam também observaram que a produção de Igf-1, uma proteína que aumenta a força muscular e a capacidade de regeneração está reduzida nestes animais submetidos ao exercício físico cronicamente.

Canadá - este grupo de pesquisa tem procurado estudar as possibilidades de sucesso do transplante de mioblastos. Neste estudo eles utlizaram camundongos com distrofia e sem miostatina, uma proteína que inibe o crescimento dos músculos. Estes camundongos apresentavam maior desenvolvimento dos músculos. Quando eles receberam transplante de mioblastos o número de fibras que expressavam a distrofina era maior que nos camundongos que tinham a miostatina. A inibição da miostatina pode ser uma alternativa bastante promissora no tratamento da distrofia muscular.

USA - a miostatina é uma proteína inibidora do crescimento muscular; camundongos sem miostatina apresentam crescimento muscular importante. No presente estudo os autores inibiram a ação da miostatina através do aumento de outras proteínas antagonistas do papel da miostatina como a folastatina, ativador do receptor tipo II e miostatina propeptideo). Camundongos modificados geneticamente para expressar estas proteínas antagonistas da miostatina apresentaram aumento da massa muscular e da força muscular comparável aos camundongos sem a miostatina. Esta estratégia poderia ser útil para minimizar os sintomas de todas as formas de distrofia muscular. Pesquisas deverão ser feitas para descobrir medicamentos que possam ter este efeito.

USA - um produto químico utilizado em indústrias químicas e farmacêuticas pode impedir o dano muscular cardíaco em camundongos com distrofia muscular. É o poloxamer 188, cujas pesquisas já foram publicadas aqui em 2001/2002. A ausência de distrofina prejudica o relaxamento do músculo cardíaco e ficam vulneráveis durante a contração cardíaca. Quarenta por cento dos camundongos desenvolveram doença cardíaca sem o uso da droga enquanto que os tratados com poloxamer 188 não tiveram esta manifestação. A droga funciona como um "cimento" causando fechamento da membrana celular e protegendo a célula dos danos causados pela ausência de distrofina. Ela também tem sido testada na anemia falciforme e não há previsão de quanto os testes com seres humanos terão início.

USA - o Parent Project é um grupo de pais, parentes e amigos dos portadores de Distrofia Muscular de Duchenne. O encontro anual da entidade reune renomados especialistas para apresentar aos pais as últimas novidades em pesquisas. A maioria das informações são bem elaboradas e muito úteis.

USA - os pesquisadores utilizaram camundongos com deficiência em laminina alfa 2. Os animais receberam terapia gênica com adenovirus que levou uma miniatura do gene agrin. Os estudos demonstraram uma melhora das alterações dos músculos dos camundongos tratados; aumento global dos músculos e aumento da sobrevida (quadruplicado). Este é mais um exemplo das possibilidades de tratamento das distrofias com terapia gênica.

Brasil - este Congresso reune importantes pesquisadores na área da distrofia muscular, tanto na parte clínica quanto experimental; inúmeros trabalhos serão apresentados neste encontro e eu selecionei os principais, que se relacionam com a parte de tratamento das doenças.  Há muitos artgios falando dos benefícios dos corticóides em distrofia muscular de Duchenne. Há também interessantes pesquisas na área de tratamento das distrofias, inclusive com experimentos com células tronco e terapia gênica. Os resumos são escritos em inglês e pelo volume de informação não é possível traduzí-los na integra. Esta é a versão mais completa dos resumos do que a colocada na página News in DMD. Os resumos podem ser lidos clickando abaixo:

Estudos clínicos

Estudos experimentais

Japão - a mutação de ponto ocorre em uma porcentagem pequena de pacientes com distrofia muscular de Duchenne. Nestes pacientes alguns estudos tem demonstrado que a gentamicina pode ajudar. No entanto a casos que a droga não causa nenhum efeito. Este grupo de pesquisadores conseguiu  identificar que os pacientes com a mutação de ponto TGA respondem ao tratamento com gentamicina e demonstraram in vitro que as células destes portadores passam a produzir distrofina quando tratadas com gentamicina. O resumo deste artigo pode ser lido a seguir:

(IN PRESS: Brain & Development (2005) 27:400–405) A novel approach to identify Duchenne muscular dystrophy patients for aminoglycoside antibiotics therapy

Shigemi Kimura, Kaori Ito, Toshihiko Miyagi, Takashi Hiranuma, Kowasi Yoshioka, Shirou Ozasa, Makoto Matsukura, Makoto Ikezawa, Masafumi Matsuo, Yasuhiro Takeshima, Teruhisa Miike - Japan

Abstract

Aminoglycoside antibiotics have been found to suppress nonsense mutations located in the defective dystophin gene in mdx mice, suggesting a possible treatment for Duchenne muscular dystrophy (DMD). However, it is very difficult to find patients that are applicable for this therapy, because: (1) only 5-13% of DMD patients have nonsense mutations in the dystrophin gene, (2) it is challenging to find nonsense mutations in the gene because dystrophin cDNA is very long (14 kb), and (3) the efficiency of aminoglycoside-induced read-through is dependent on the kind of nonsense mutation. In order to develop a system for identifying candidates that qualify for aminoglycoside therapy, fibroblasts from nine DMD patients with nonsense mutation of dystrophin gene were isolated, induced to differentiate to myogenic lineage by AdMyoD, and exposed with gentamicin. The dystrophin expression in gentamicin-exposed myotubes was monitored by in vitro dystrophin staining and western blotting analysis. The results showed that gentamicin was able to induce dystrophin expression in the differentiated myotubes by the read-through of the nonsense mutation TGA in the gene; a read-through of the nonsense mutations TAA and TAG did not occur and consequently did not lead to dystrophin expression. Therefore, it is speculated that the aminoglycoside treatment is far more effective for DMD patients that have nonsense mutation TGA than for patients that have nonsense mutation TAA and TAG. In this study, we introduce an easy system to identify patients for this therapy and report for the first time, that dystrophin expression was detected in myotubes of DMD patients using gentamicin.

USA - L-arginina é uma aminoácido formador de óxido nítrico, e um ativador da utrofina. Os pesquisadores administraram L-arginina a camundongos normais e com distrofia e obervaram que os músculos apresentavam menos necrose, maior ativação da utrofina e maior resistência a contração muscular. Em outras análises não houve alteração (nível da CPK por exemplo). A L-arginina é uma promissora alternativa ao

Canadá - de longa data há relatos dos benefícios da suplementação nutricional na distrofia muscular; muitos pacientes sentem os benefícios das vitaminas, da creatina, etc. Neste estudo em camundongos os autores estudaram os efeitos do corticoide (prednisolona), complementado com o uso da creatina, ácido linoleico, ácido lipóico e betahidroximetilbutirato). O uso isolado destes suplementos demonstrou efeito mas os melhores resultados foram obtidos com a combinação deles; aumento da força muscular, redução da fadiga e melhora das alterações histológicas dos músculos. Este relato reforça a idéia de que o uso dos suplementos nutricionais em conjunto com corticóides pode retardar a evolução da distrofia, constituindo-se numa alternativa válida até que uma terapia definitiva esteja disponível.

Japão - pesquisadores alimentaram camundongos portadores de distrofia muscular, com  20 dias de idade, com dieta de pássaros com 12% de cloreto de sódio. Estes animais apresentaram 50% de redução da enzima CK com redução das fibras com necrose em 99%. A explicação encontrada pelos autores seria a redução do cálcio dos músculos o que contribuiria para menor lesão muscular.

Suíça - os inibidores de calpaína são moléculas simples que funcionam como enzimas, destruindo proteínas; neste estudo os autores descrevem um novo inibidor de calpaína que causou melhora nas alterações histológicas de camundongos com distrofia muscular.

Itália - este grupo de pesquisadores já tinha demonstrado em camundongos com distrofia que o uso do MG-132, um inibidor do proteasoma, era capaz de fazer as células musculares passar a produzir distrofina. Desta vez eles criaram um novo método de estudo de drogas em distrofia. Eles fizeram uma cultura de células musculares de portadores de distrofia muscular de Duchenne e Becker e colocaram a droga MG-132 neste meio de cultura. Após 24 horas eles observaram que estas células passaram a produzir distrofina, betadistroglican e alfasarcoglican. Este modelo poderá ser utilizado para estudo de novas drogas. O MG-132 é uma droga só utilizada em laboratório e é muito tóxica. Só existe no momento um inibidor de proteasoma liberado para uso em humanos que é utilizado no tratamento do mieloma múltiplo, uma forma de câncer.

Canadá - pesquisadores do Canadá deram um importante passo na pesquisa de uma terapia definitiva da distrofia miotônica. Camundongos portadores do gene humano da distrofia miotônica foram submetidos a terapia gênica com o objetivo de neutralizar a doença. Os resultados foram apresentados na 5a Conferência Internacional de Distrofia Miotônica, em Quebec no Canadá. A distrofia miotônica também conhecida como doença de Steinert  é a forma de distrofia mais frequente em adultos com incidência de 1 para 10000 na maioria dos países. Em algumas regiões a inicdência pode ser 20 vezes maior (1 em cada 500 pessoas).

França - os autores deste trabalho e outros autores já tinham relatado que a L-arginina pode aumentar a utrofina e compensar a deficiência de distrofina em camundongos com distrofia muscular, atuando através do óxido nítrico. Neste estudo usando ressonância magnética e análise dos músculos eles comprovaram este efeito em camundongos. Eles testaram uma outra droga, denominada molsidomine, uma droga que gera óxido nítrico, e observaram também uma melhora muscular. Eles concluem que o uso de drogas que atuam sobre o óxido nítrico é uma ótima estratégia para tratamento da distrofia muscular de Duchenne, enquanto a terapia definitiva não estiver disponível. O resumo do artigo poder ser lido abaixo:

(IN PRESS: Neurobiology of Disease 2005;20(1):123-30) L-arginine improves dystrophic phenotype in mdx mice

Vincent Voisin, Catherine Sébrié, Stéfan Matecki, Hua Yu, Brigitte Gillet, Michèle Ramonatxo, Maurice Israel and Sabine De la Porte - France

Abstract

A possible treatment for Duchenne muscular dystrophies would be to compensate for dystrophin loss by increasing the expression of utrophin, another cytoskeletal protein of the muscle membrane. We previously found that l-arginine, the substrate for nitric oxide synthase, significantly increased utrophin level in muscle and targeted it to the sarcolemma. Here, we have addressed the expected benefit in the mdx mice. Magnetic resonance imaging of lower limbs revealed a 35% reduction of the necrotic zones, confirmed by histological staining of muscles. This regression of the necrosis was also supported by the drastic reduction of Evans blue incorporation, a cell impermeable dye. The creatine kinase level in the serum decreased by 57%. Utrophin level increased 2- to 3-fold in muscles. β-dystroglycan was relocalised with utrophin to the membrane. In the diaphragm, the most affected muscle in mdx mice, the isometric tension increased by 30%, with regression of collagen and of cytoplasmic lipid overloading. Finally, molsidomine, a therapeutic agent that is converted to a NO donor, also attenuated the dystrophic phenotype. Our results suggest that pharmacological activators of the NO pathway may constitute a realistic treatment for Duchenne and Becker muscular dystrophies.

USA - há vários trabalhos demonstrando que a ressonância nuclear magnética e a espectroscopia por ressonância são capazes de analisar as alterações musculares na distrofia. Neste estudo em camundongos os autores utilizaram estes dois métodos para observar os resultados da terapia gênica. Estes métodos foram eficazes e serão muito úteis quando a terapia gênica estiver disponível para utilização em seres humanos, para reduzir a necessidade de  realização de biópsias musculares no decorrer do tratamento.

USA - neste encontro serão apresentados poucos artigos importantes relacionados com distrofia muscular. Os principais resumos em inglês podem ser lidos aqui. Os mais importantes são dois artigos descrevendo mediadores da fibrose muscular em camundongos com distrofia muscular cuja inibição poderia retardar a evolução da doença; outro artigo interessante é a pesquisa das células tronco que tem maior capacidade de se diferenciar em células musculares.

USA - A utrofina é uma proteína com capacidade de substituir as funções da distrofina e reduzir os sintomas da doença. Camundongos sem distrofina e sem utrofina apresentam agravamento das alterações cardíacas. O uso de L-arginina pode causar aumento da utrofina e justificar o seu uso precoce na distrofia muscular. O resumo do trabalho em inglês pode ser lido abaixo:

(IN PRESS: Am.J.Physiol.Heart.Circ.Physiol 289:H2373-H2378,2005) Utrophin deficiency worsens cardiac contractile dysfunction present in dystrophin-deficient mdx mice

Paul M. L. Janssen, Nitisha Hiranandani, Tessily A. Mays, and Jill A. Rafael-Fortney - USA

The loss of dystrophin in patients with Duchenne muscular dystrophy (DMD) causes devastating skeletal muscle degeneration and cardiomyopathy. Dystrophin-deficient (mdx) mice have a much milder phenotype, whereas double knockout (DKO) mice lacking both dystrophin and its homolog, utrophin, exhibit the clinical signs observed in DMD patients. We have previously shown that DKO and mdx mice have similar severities of histological features of cardiomyopathy, but no contractile functional measurements of DKO heart have ever been carried out. To investigate whether DKO mice display cardiac dysfunction at the tissue level, contractile response of the myocardium was tested in small, unbranched, ultrathin, right ventricular muscles. Under near physiological conditions, peak isometric active developed tension (Fdev, in mN/mm2) at a stimulation frequency of 4 Hz was depressed in DKO mice (15.3 ± 3.7, n = 8) compared with mdx mice (24.2 ± 5.4, n = 7), which in turn were depressed compared with wild-type (WT) control mice (33.2 ± 4.5, n = 7). This reduced Fdev was also observed at frequencies within the murine physiological range; at 12 Hz, Fdev was (in mN/mm2) 11.4 ± 1.8 in DKO, 14.5 ± 4.2 in mdx, and 28.8 ± 5.4 in WT mice. The depression of Fdev was observed over the entire frequency range of 4–14 Hz and was significant between DKO versus mdx mice, as well as between DKO or mdx mice versus WT mice. Under beta-adrenergic stimulation (1 µmol/l isoproterenol), Fdev in DKO preparations was only (in mN/mm2) 14.7 ± 5.1 compared with 30.9 ± 8.9 in mdx and 41.0 ± 4.9 in WT mice. These data show that cardiac contractile dysfunction of mdx mice is generally worsened in mice also lacking utrophin.

França - os autores estudaram a terapia gênica em camundongos com distrofia muscular tipo cinturas tipo 2a por deficiência de calpaína 3. Vetores virais com o gene da calpaína 3. As alterações dos músculos regrediram com recuperação da força contrátil, sem evidência de qualquer efeito colateral. É mais um trabalho que demonstra a viabilidade desta terapia gênica em diversas formas de distrofia muscular

Austrália - o uso de oligonucleotídeos pode reduzir os sintomas da distrofia muscular e transformar a distrofia mais severa em uma forma mais branda (por exemplo transformar a distrofia de Duchenne em Becker). Há pelo menos 3 grupos estudando esta possibilidade de tratamento, alguns deles já se preparando para estudos clínicos em seres humanos. Este estudo demonstrou que a aplicação de oligonucleotídeos localizada ou por via sistêmica causa expressão da distrofina em camundongos com distrofia muscular demonstrando mais uma vez a viabilidade desta forma de tratamento.

Inglaterra - a trehalose é uma substância que impede a agregação de proteínas e já foi estudada com sucesso em camundongos com uma doença semelhante a doença de Huntington; os autores utilizaram esta droga em um camundongos com a mesma alteração observada na distrofia óculo-faríngea. O uso da droga por via oral contribui para uma redução da fraqueza muscular e das alterações patológicas nos camundongos. O próximo passo é provar que a droga é efetiva em seres humanos com distrofia óculo-faríngea.

Holanda - a ídeia não é nova; os pesquisadores estudam o potenciam das células tronco da medula óssea no tratamento da distrofia muscular de Duchenne; a ideía seria utilizar células da medula do próprio paciente e corrigí-las com vetores virais; colocadas em meio de cultura estas células participaram da síntese de novos mioblastos. O estudo em tubo de ensaio mostrou a possibilidade desta forma de tratamento, apesar de que os estudos estão ainda muito no início.

USA - esta equipe de pesquisa criou um camundongo sem miostatina e que apresentou um aumento da massa muscular. Agora eles descrevem uma droga que pode aumentar a massa muscular em até 60%.  Trata-se da ACVR2B que inibe a miostatina e que pode ter outros efeitos também nos músculos. É um promissor caminho para tratamento de disversas formas de distrofia muscular. A repercussão da pesquisa pode ser lida abaixo:

'Mighty Mice': New Muscle-building Agent Beats All Previous Ones

USA - o adenovirus é um dos vírus estudados para carregar o gene da distrofina  para utilização na terapia gênica; os autores neste artigo fazem uma revisão dos conhecimentos atuais sobre esta técnica para tratamento da distrofia muscular de Duchenne e discutem os avanços recentes.

USA - a entrada de excesso de cálcio é uma das razões da degeneração das fibras musculares em portadores de distrofia. Neste estudo em animais a expressão aumentada do gene BCL-2 reduziu a entrada de cálcio e a degeneração das fibras musculares.

USA - um dos problemas relacionados ao sucesso da terapia gênica é a expressão do gene a longo prazo, isto é, o número de fibras que podem ser corrigidas com este tratamento. Este grupo de trabalho utilizou dois genes em camundongos para tentar corrigir a distrofia muscular; além do gene da distrofina foi utilizado um gene de uma enzima integrase tentando obter melhor sucesso na incorporação do gene da distrofina. O estudo mostrou que com estes dois genes a expressão da distrofina pode aumentar em 5 a 10 vezes o que melhoraria muito o resultado do tratamento.

Esta notícia pode ser lida com outros comentários aqui.

Itália - estudos prévios demonstraram que o fator nuclear kappa beta está envolvido com a degeneração muscular. Neste estudo em camundongos os pesquisadores inibiram este fator utilizando a droga pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC). Os animais tratados apresentaram aumento da força muscular e redução da degeneração dos músculos. O resumo do artigo que será publicado brevemente poderá ser lido, em inglês, abaixo:

(IN PRESS: Experimental Neurology,2006) Nuclear factor kappa-B blockade reduces skeletal muscle degeneration and enhances muscle function in Mdx mice

Sonia Messina, Alessandra Bitto, M'hammed Aguennouz, Letteria Minutoli, Maria C. Monici, Domenica Altavilla, Francesco Squadrito, Giuseppe Vita  - Italy

Abstract

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a progressive muscle-wasting disease due to a mutation in the dystrophin gene and the consequential protein deficiency in muscle. How the lack of the sarcolemmal protein dystrophin gives rise to the final disease status is still not clear. Several evidences suggest a role of nuclear factor kappa-B (NF-κB), a pleiotropic transcription factor, in muscle degeneration and regeneration in DMD patients and mdx mice. We investigated the effects of NF-κB blocking by pyrrolidine dithiocarbamate (PDTC), a well-known NF-κB inhibitor, on dystrophic process in mdx mice. Five-week-old mdx and wild-type mice received three times a week for 5 weeks either PDTC (50 mg/kg) or its vehicle. PDTC treatment: (i) increased forelimb strength (+20%; P < 0.05) and strength normalized to weight (+24%; P < 0.05) and a decreased fatigue percentage (−61%; P < 0.05) in mdx mice, (ii) blunted the augmented NF-κB nuclear binding activity and the enhanced TNF-α expression in dystrophic muscles (P < 0.01), (iii) at a quantitative morphological evaluation of extensor digitorum longus (EDL) and biceps muscles, increased area with normal fibers (P < 0.05, in EDL), reduced muscle necrosis (P < 0.05 in biceps; P < 0.01 in EDL), and enhanced muscle regeneration (P < 0.01, in biceps). Our data support the hypothesis that NF-κB contributes to the perpetuation of the dystrophic damage and show that its blockade produces beneficial effects on functional, biochemical, and morphological parameters

Suiça - este artigo divulga uma pesquisa que já foi noticiada no site; os pesquisadores suiços demonstraram em camundongos que o uso de chá verde aumenta a força muscular. Não há uma explicação clara sobre o mecanismo de ação do chá verde apesar de se conhecer as propriedades anti-oxidantes deste chá.

USA - existe uma forma de distrofia muscular congênita denominada músculo-olho-cérebro. Neste estudo os pesquisadores identificaram uma proteína a acetylglucosaminyltransferase 1 nos fibroblastos e linfoblastos; esta enzima tem sua atividade reduzida em fibroblastos e linfoblastos de pacientes com distrofia músculo-olho-cérebro e nos portadores do gene defeituoso.  O resumo do trabalho, em inglês, que será publicado em breve na revista Neuromuscular Disorders pode ser lido abaixo:

Carriers and patients with muscle–eye–brain disease can be rapidly diagnosed by enzymatic analysis of fibroblasts and lymphoblasts

Jiri Vajsar,  Wenli Zhang, William B. Dobyns, Doug Biggar, Kenton R. Holden e, Cynthia Hawkins, Peter Ray, Ann H. Olney, Catherine M. Burson, Anand K. Srivastava, Harry Schachter

Abstract

We report a new fibroblast and lymphoblast based protein O-mannosyl b-1,2-N-acetylglucosaminyltransferase 1 enzymatic assay, which allows rapid and accurate diagnosis of carriers and patients with muscle–eye–brain type of congenital muscular dystrophy. Seven patients with genetically confirmed muscle–eye–brain disease were assayed for protein O-mannosyl b-1,2-N-acetylglucosaminyltransferase 1 enzyme activity. In three patients and their heterozygous parents, the assays were done on EBV-transformed lymphoblasts, in another three patients they were done on cultured fibroblasts and in the last patient on both fibroblasts and lymphoblasts. Cultured fibroblasts and lymphoblasts from the muscle–eye–brain patients showed a highly significant decrease in protein O-mannosyl b-1,2-N-acetylglucosaminyltransferase 1 activity relative to controls. The residual protein O-mannosyl b-1,2-N-acetylglucosaminyltransferase 1 level in fibroblasts (average 0.11 nmoles/h per mg) was about 13% of normal controls. The ratio of protein O-mannosyl b-1,2-N-acetylglucosaminyltransferase 1 activity to the activity of a glycosyltransferase control (N-acetylglucosaminyltransferase 1; GnT1) in fibroblasts was on average 0.006 in muscle–eye–brain patients and 0.045 in controls. The average residual protein O-mannosyl b-1,2-N-acetylglucosaminyltransferase 1 level in lymphoblasts was 15% of normal controls. The average ratio of protein O-mannosyl b-1,2-N-acetylglucosaminyltransferase 1/GnT1 activity was 0.007 in muscle–eye–brain patients, 0.026 in heterozygous carriers and 0.046 in normal controls. Assay of protein O-mannosyl b-1,2-Nacetylglucosaminyltransferase 1 activity in fibroblasts and lymphoblasts from muscle–eye–brain carriers and patients provides a rapid and relatively simple diagnostic test for this disease and could be used as a screening test in carriers and patients with complex congenital muscular dystrophy.

USA - a empresa VASTox divulgou hoje que identificou algumas pequenas moléculas com capacidade de aumentar a produção de utrofina. A utrofina é uma proteína da célula que pode substituir as funções da distrofina, a proteína defeituosa da distrofia muscular de Duchenne. A empresa irá selecionar dentre estas moléculas a que tem melhor capacidade e menos efeitos colaterais para iniciar testes em 2007.

Holanda e Suiça - este grupo de pesquisadores criou um novo vírus para transportar o gene da distrofina. Este vírus em contato com células musculares de Duchenne em tubos de ensaio promoveu uma robusta produção de distrofina. Este estudo deverá ser realizado antes em laboratório para se analisar se o resultado será semelhante. O resumo em inglês do artigo pode ser lido abaixo:

(IN PRESS: Molecular Therapy, 2006) Transduction of Myogenic Cells by Retargeted Dual High-Capacity Hybrid Viral Vectors: Robust Dystrophin Synthesis in Duchenne Muscular Dystrophy Muscle Cells

Manuel A. F. V. Goncalves, Maarten Holkers, Christophe Cudre-Mauroux, Gijsbert P. van Nierop, Shoshan Knaa¨n-Shanzer, Ietje van der Velde, Dinko Valerio, and Antoine A. F. de Vries -The Netherlands and  Switzerland

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is caused by mutations in the dystrophin gene (DMD), making it amenable to gene- or cell-based therapies. Another possible treatment entails the combination of both principles by transplantation of autologous myogenic cells after their genetic complementation. This approach requires efficient and stable transduction of these cells with recombinant DMD. Recently, we generated a dual high-capacity (hc) adenovirus (Ad)–adeno-associated virus (AAV) hybrid vector (HV) that can deliver two full-length dystrophin-encoding modules into target cells. We showed that HV transduction of human cells containing AAV Rep proteins leads to the insertion of foreign DNA into the AAVS1 locus. Here, we improved HV entry into muscle cells from DMD patients. After having verified that these cells barely express the coxsackie B virus and Ad receptor (CAR), which constitutes the attachment molecule for Ad serotype 5 (Ad5) fibers, we equipped dual hcAd/ AAV HV particles with Ad serotype 50 fiber domains to achieve CAR-independent uptake. These retargeted vectors complemented much more efficiently the genetic defect of dystrophin-defective myoblasts and myotubes than their isogenic counterparts with conventional Ad5 fibers. Importantly, the accumulation of B-dystroglycan along the membranes of vector-treated DMD myotubes indicated proper assembly of dystrophin-associated glycoprotein complexes.

 

Canadá - completando a notícia anterior este artigo faz uma revisão do as possibilidades de aumentar a utrofina e diminuir os sintomas da distrofia muscular de Duchenne. O resumo em inglês do artigo pode ser lido abaixo:

(IN PRESS: Trends in Molecular Medicine, 2006) Utrophin upregulation for treating Duchenne or Becker muscular dystrophy: how close are we?

Pedro Miura and Bernard J. Jasmin - Canada

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a severe muscle-wasting disorder for which there is currently no effective treatment. This disorder is caused by mutations or deletions in the gene encoding dystrophin that prevent expression of dystrophin at the sarcolemma. A promising pharmacological treatment for DMD aims to increase levels of utrophin, a homolog of dystrophin, in muscle fibers of affected patients to compensate for the absence of dystrophin. Here, we review recent developments in our understanding of the regulatory pathways that govern utrophin expression, and highlight studies that have used activators of these pathways to alleviate the dystrophic symptoms in DMD animal models. The results of these preclinical studies are promising and bring us closer to implementing appropriate utrophin-based drug therapies for DMD patients.

Inglaterra - o uso de oligonucleotídeos é uma das alternativas da terapia gênica; funcionaria como um corretor do defeito genético atenuando-o. Neste estudo em camundongos os oligonucleotideos injetados semanalmente aumentaram a expressão de distrofina e melhoraram a função muscular. Apesar da quantidade de distrofina variar entre os músculos é uma alternativa que poderá ser viabilizada em pouco tempo (ver notícia publicada hoje sobre as entidades).

USA - o uso de corticóides já está bem estabelecido como uma forma de tratamento de algumas formas de distrofia como a de Duchenne e Becker. Vários estudos em camundongos que tem ausência de distrofina demonstraram que a L-arginina melhora a força muscular. Inclusive muitos pacientes já tem utilizado a L-arginina sem que o seu efeito esteja demonstrado completamente em seres humanos. Neste estudo os autores demonstraram  que o deflazacort, uma forma de corticóide, associado a L-arginina poupa os músculos da lesão induzida pelo exercício e aumenta a força muscular dos animais. Para os autores os resultados podem indicar que esta associação possa ser efetiva também em humanos para melhorar a qualidade de vida dos portadores de distrofia muscular de Duchenne e Becker.

USA - neste estudo foram utilizados os camundongos deficientes em distrofina e em utrofina, que apresentam  fraqueza muscular semelhante a doença humana. Eles foram tratados com o gene da distrofina da retina. Eles apresentaram aumento da força muscular e da sobrevida. O resumo em inglês do artigo que será publicado em breve poderá ser lido abaixo:

(IN PRESS: Neuromuscular Disorders, 2006) Improvement in survival and muscle function in an mdx/utrn−/− double mutant mouse using a human retinal dystrophin transgene

Roger Gaedigk, Douglas J. Law, Kathleen M. Fitzgerald-Gustafson, Steven G. McNulty, Ndona N. Nsumu, Ann C. Modrcin, Robert J. Rinaldi, David Pinson, Stephen C. Fowler, Mehmet Bilgen, Joanne Burns, Stephen D. Hauschka and Robert A. White - USA

Duchenne muscular dystrophy  is a progressive muscle disease characterized by increasing muscle weakness and death by the third decade. mdx mice exhibit the underlying muscle disease but appear physically normal with ordinary lifespans, possibly due to compensatory expression of utrophin. In contrast, double mutant mice (mdx/utrn−/−), deficient for both dystrophin and utrophin die by not, vert, similar3 months and suffer from severe muscle weakness, growth retardation, and severe spinal curvature. The capacity of human retinal dystrophin (Dp260) to compensate for the missing 427 kDa muscle dystrophin was tested in mdx/utrn−/− mice. Functional outcomes were assessed by histology, EMG, MRI, mobility, weight and longevity. MCK-driven transgenic expression of Dp260 in mdx/utrn−/− mice converts their disease course from a severe, lethal muscular dystrophy  to a viable, mild myopathic phenotype. This finding is relevant to the design of exon-skipping therapeutic strategies since Dp260 lacks dystrophin exons 1-29.

USA -  a formação de fibrose é um achado comum na distrofia muscular de Duchenne. A pentoxifilina é uma droga muito estudada em camundongos com distrofia muscular com resultados positivos. Neste estudo a droga utilizada por 4 semanas não teve efeito sobre as alterações do músculo diafragma dos camundongos com distrofia muscular.

Itália - este trabalho já tinha sido apresentado no Congressso Mundial de Músculo em 2005; os autores estudaram a IRFI-042, derivada da vitamina E e que tem um potente efeito antixidante. Esta droga reduziu as alterações patológicas dos camundongos com distrofia muscular e aumentou a força muscular. A próxima etapa é a pesquisa da droga em seres humanos. O resumo em inglês do artigo que será publicado em breve está a seguir:

(IN PRESS: American Journal of Pathology 2006;168:918-26) Lipid Peroxidation Inhibition Blunts Nuclear Factor-B Activation, Reduces Skeletal Muscle Degeneration, and Enhances Muscle Function in mdx Mice

Sonia Messina, Domenica Altavilla, M’hammed Aguennouz, Paolo Seminara, Letteria Minutoli, Maria C. Monici, Alessandra Bitto, Anna Mazzeo, Herbert Marini, Francesco Squadrito and Giuseppe Vita  - Italy

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a progressive muscle-wasting disease resulting from lack of the sarcolemmal protein dystrophin. However, the mechanism leading to the final disease status is not fully understood. Several lines of evidence suggest a role for nuclear factor (NF)-B in muscle degeneration as well as regeneration in DMD patients and mdx mice. We investigated the effects of blocking NF-B by inhibition of oxidative stress/lipid peroxidation on the dystrophic process in mdx mice. Five-week-old mdx mice received three times a week for 5 weeks either IRFI-042 (20 mg/kg), a strong antioxidant and lipid peroxidation inhibitor, or its vehicle. IRFI-042 treatment increased forelimb strength (+22%, p < 0.05) and strength normalized to weight (+23%, p < 0.05) and decreased fatigue (–45%, p < 0.05). It also reduced serum creatine kinase levels (p < 0.01) and reduced muscle-conjugated diene content and augmented muscle-reduced glutathione (p < 0.01). IRFI-042 blunted NF-B DNA-binding activity and tumor necrosis factor- alpha expression in the dystrophic muscles (p < 0.01), reducing muscle necrosis (p < 0.01) and enhancing regeneration (p < 0.05). Our data suggest that oxidative stress/lipid peroxidation represents one of the mechanisms activating NF-B and the consequent pathogenetic cascade in mdx muscles. Most importantly, these new findings may have clinical implications for the pharmacological treatment of patients with DMD.

Itália - BN 82270 é uma nova molécula formada da união de duas outras e que apresenta dois mecanismos de ação importantes para o tratamento da distrofia muscular; a droga tem efeito antioxidante e inibidor da calpaína. O estudo desta droga demonstrou claramente efeitos benéficos com redução da CK, redução da citocina pró-fibrótica TGF-beta 1. O efeito positivo não foi uniforme em todos os músculos e os pesquisadores deste grupo liderado por Annamaria de Lucca ainda estão estudando em camundongos a dose que poderia oferecer melhores resultados sem efeitos colaterais tóxicos para o organismo. O resumo em inglês deste artigo que será  publicado em breve na revista Neuromuscular Disorders pode ser lido abaixo:

First evaluation of the potential effectiveness in muscular dystrophy of a novel chimeric compound, BN 82270, acting as calpain-inhibitor and anti-oxidant

Rosa Burdi, Maria Paola Didonna, Bernadette Pignol, Beatrice Nico, Domenica Mangieri , Jean-Francois Rolland, Claudia Camerino, Alberta Zallone , Paolo Ferro , Francesca Andreetta, Paolo Confalonieri, Annamaria De Luca - Italy

BN 82270 is a membrane-permeable prodrug of a chimeric compound (BN 82204) dually acting as calpain inhibitor and anti-oxidant. Acute in vivo injection of dystrophic mdx mice (30 mg/kg, s.c.) fully counteracted calpain overactivity in diaphragm. A chronic 4–6 weeks administration significantly prevented in vivo the fore limb force drop occurring in mdx mice exercised on treadmill. Ex vivo electrophysiological recordings showed that BN 82270 treatment contrasted the decrease in chloride channel function (gCl) in diaphragm, an index of spontaneous degeneration, while it was less effective on both exercise-impaired gCl and calcium-dependent mechanical threshold of the hind limb extensor digitorum longus (EDL) muscle fibres. The BN 82270 treated mdx mice showed a marked reduction of plasma creatine kinase and of the pro-fibrotic cytokine TGF-b1 in both hind limb muscles and diaphragm; however, the histopathological profile of gastrocnemious muscle was poorly ameliorated. In hind limb muscles of treated mice, the active form was detected by HPLC in the low therapeutic concentration range. In vitro exposure to 100 mM BN 82270 led to higher active form in diaphragm than in EDL muscle. This is the first demonstration that this class of chimeric compounds, dually targeting pathology-related events, exerts beneficial effects in muscular dystrophy. The drug/prodrug system may require posology adjustment to produce wider beneficial effects on all muscle types.

USA - células tronco mesenquimais são células musculares com potencial para se transformar em células musculares. Nas doenças genéticas elas não podem ser utilizadas no tratamento da doença porque elas carregam o defeito genético. Nesta pesquisa em laboratório os pesquisadores utilizaram um vetor viral com um microgene da distrofina para corrigir as células tronco mesenquimais de camundongos. Estas células passaram a expressar a distrofina e poderiam ser utilizadas no tratamento da doença. Falta ainda provar que estas células injetadas nos animais sejam capaz de corrigir a doença, escolher a via de administração e muitos outros detalhes para que, no futuro, este estudo possa ser utilizado em seres humanos.

USA - este estudo foi feito em camundongos com deficiência em distrofina e utrofina; são camundongos que apresentam uma intensa fraqueza muscular; os animais com dois meses de vida foram tratados com vetores contendo um microgene da distrofina. Após dois meses houve uma significativa melhora das alterações musculares  e um significativo aumento da força muscular. Em resumo um resultado bastante promissor. O resumo em inglês do artigo que será publicado em breve está abaixo:

(IN PRESS: Molecular Therapy, 2006) C-Terminal-Truncated Microdystrophin Recruits Dystrobrevin and Syntrophin to the Dystrophin-Associated Glycoprotein Complex and Reduces Muscular Dystrophy in Symptomatic Utrophin/Dystrophin Double-Knockout Mice

Yongping Yue,  Mingju Liu,  and Dongsheng Duany - USA

C-terminal-truncated (DC) microdystrophin is being developed for Duchenne muscular dystrophy gene therapy. Encouraging results have been achieved in the mdx mouse model. Unfortunately, mdx mice do not display the same phenotype as human patients. Evaluating DC microdystrophin in a symptomatic model will be of significant relevance to human trials. Utrophin/dystrophin doubleknockout (u-dko) mice were developed to model severe dystrophic changes in human patients. In this study we evaluated the therapeutic effect of the DR4-R23/DC microdystrophin gene (DR4/DC) after serotype-6 adeno-associated virus-mediated gene transfer in neonatal u-dko muscle. At 2 months after gene transfer, the percentage of centrally nucleated myofiber was reduced from 89.2 to 3.4% and muscle weight was normalized. Furthermore, we have demonstrated for the first time that DC microdystrophin can eliminate interstitial fibrosis and macrophage infiltration and restore dystrobrevin and syntrophin to the dystrophin-associated glycoprotein complex. Interestingly neuronal nitric oxide synthase was not restored. The most impressive results were achieved in muscle force measurement. Neonatal gene therapy increased twitch- and tetanic-specific force. It also brought the response to eccentric contraction-induced injury to the normal range. In summary, our results suggest that the DR4/DC microgene holds great promise in preventing muscular dystrophy.

USA - será realizado de 23 a 26 de abril de 2006 em Dallas no Texas um encontro de especialistas americanos e convidados do mundo todo para discutir os avanços das pesquisas sobre as doenças musculares. A maioria dos trabalhos é experimental, em camundongos e há poucos trabalhos clínicos como que demonstra os efeitos a longo prazo do uso dos corticóides na distrofia muscular de Duchenne. Muitos dos trabalhos abordam os avanços na terapia gênica no tratamento dos distrofias, sendo que alguns já foram divulgados anteriormente. Há poucos estudos com o uso de drogas e um dos que será apresentado é o realizado no Centro de Pesquisa em Distrofia Muscular da AADM (Ribeirão Preto); utilizando camundongos com distrofia muscular os pesquisadores obtiveram aumento de força e redução das alterações patológicas com a utilização da olopatadina, uma droga antihistamínica H1 que pode atuar por redução da atividade inflamatória e/ou reduzindo a entrada de cálcio nas fibras musculares. O Centro de Pesquisas da AADM foi criado por pais e amigos dos portadores de distrofia e precisa do apoio financeiro para poder manter as pesquisas que já estão em andamento.

USA - estudantes americanos do segundo grau Lalith Polepeddi e Mike Polmear identificaram uma substância que pode contribuir para o tratamento da distrofia muscular de Duchenne; a substância funciona com um "cimento" protegendo a membrana celular e reduzindo as alterações patológicas dos músculos; o trabalho foi realizado em camundongos com distrofia muscular. Para ver um vídeo em inglês desta notícia é só acessar aqui.

Austrália - estudos prévios com camundongos geneticamente modificados para superexpressão do  Igf-1 apresentam aumento da força muscular. Neste estudo o Igf-1 foi administrado sistemicamente para camundongos com distrofia muscular. Com este tratamento houve aumento do status oxidativo, observado pela atividade enzimática, e redução das alterações patológicas do músculo. O resumo em inglês pode ser lido abaixo:

(IN PRESS: Am J Physiol Endocrinol Metab - April 18, 2006) Systemic administration of IGF-I enhances oxidative status and reduces contraction-induced injury in skeletal muscles of mdx dystrophic mice

Jonathan D. Schertzer, James G. Ryall, and Gordon S Lynch - Australia

The absence of dystrophin and resultant disruption of the dystrophin glycoprotein complex renders skeletal muscles of dystrophic patients and dystrophic mdx mice susceptible to contraction-induced injury. Strategies to reduce contraction-induced injury are of critical importance because this mode of damage contributes to the etiology of myofiber breakdown in the dystrophic pathology. Transgenic over-expression of insulin-like growth factor-I (IGF-I) causes myofiber hypertrophy, increases force production, and can improve the dystrophic pathology in mdx mice. In contrast, the predominant effect of continuous exogenous administration of IGF-I to mdx mice at a low dose (1.0-1.5 mg/kg/day) is a shift in muscle phenotype from fast glycolytic toward a more oxidative, fatigue resistant, slow muscle without alterations in myofiber cross sectional area, muscle mass or maximum force producing capacity. We found that exogenous administration of IGF-I to mdx mice increased myofiber succinate dehydrogenase activity, shifted the overall myosin heavy chain isoform composition toward a slower phenotype, and most importantly, reduced contraction-induced damage in tibialis anterior (TA) muscles. The deficit in force producing capacity after two damaging lengthening contractions was reduced significantly in TA muscles of IGF-I treated (53 ± 4%) compared with untreated mdx mice (70 ± 5%, P < 0.05). The results provide further evidence that IGF-I administration can enhance the functional properties of dystrophic skeletal muscle and, when compared to results in transgenic mice or viral-mediated over-expression, highlight the disparities in different models of endocrine factor delivery.

USA -  o uso de células tronco pode ser uma possibilidade no tratamento das distrofias; neste estudo células tronco musculares. Células tronco de origem muscular já foram transplantadas em camundongos por via venosa com distrofia muscular com poucas células expressando a distrofina. Neste estudo as células foram injetadas em artérias. Com este tratamento houve um aumento da expressão(5-8%) e foi possível demonstrar que estas células se diferenciaram em músculos. Este estudo é mais um passo na busca de uma melhor alternativa para o tratamento da distrofia muscular com células tronco.

Itália - a TGF-1 é uma citocina relacionada a fibrose; o seu bloqueio poderia auxliar no tratamento da distrofia muscular de Duchenne; neste estudo em camundongos o bloqueio da TGF-beta 1 com anticorpos causou uma melhora da alterações  musculares o que foi um efeito positivo; no entanto eles observaram um aumento das células inflamatórias, o que poderia ser prejudicial e não era um efeito previsto e que não pode ser explicado. O resumo em inglês do artigo que será publicado em breve pode ser lido abaixo:

(IN PRESS: Journal of Neuroimmunology 2006) Immunomodulation of TGF-beta1 in mdx mouse inhibits connective tissue proliferation in diaphragm but increases inflammatory response: Implications for antifibrotic therapy

Francesca Andreetta, Pia Bernasconi, Fulvio Baggi, Paolo Ferro, Laura Oliva, Elisa Arnoldi, Ferdinando Cornelio, Renato Mantegazza, Paolo Confalonieri - Italy

Irreversible connective tissue proliferation in muscle is a pathological hallmark of Duchenne muscular dystrophy (DMD), a genetic degenerative muscle disease due to lack of the sarcolemmal protein dystrophin. Focal release of transforming growth factor-beta1 (TGF-h1) is involved in fibrosis development. Murine muscular dystrophy (mdx) is genetically homologous to DMD and histopathological alterations comparable to those in DMD muscles occur in diaphragm of older mdx mice. To investigate the early development of fibrosis and TGF-h1 involvement, we assessed diaphragms in 6–36-week-old mdx and C57/BL6 (control) mice for fibrosis, and used real-time PCR and ELISA to determine TGF-h1 expression. Significantly greater fibrosis and TGF-h1 expression were found in mdx from the 6th week. Mice treated with neutralizing antibody against TGF-h1 had lower levels of TGF-h1 protein, reduced fibrosis, unchanged muscles fiber degeneration/ regeneration, but increased inflammatory cells (CD4+lymphocytes). These data demonstrate early and progressive fibrosis in mdx diaphragm accompanied by TGF-h1 upregulation. Reduction of TGF-h1 appears promising as a therapeutic approach to muscle fibrosis, but further studies are required to evaluate long term effects of TGF-h1 immunomodulation on the immune system.

USA - neste encontro de especialistas em terapia gênica serão apresentados 30 pesquisas sobre o uso da terapia gênica em diversas formas de distrofia muscular experimental. São estudos importantes mas ainda sob pesquisa, não havendo nenhum estudo de aplicação imediata.

USA -  a miostatina é um peptídeo que reduz o crescimento muscular; a sua ausência causa hipertrofia muscular e aumenta a capacidade de regeneração dos músculos. Neste estudo em camundongos com distrofia tipo cintura os camundongos jovens com deleção do gene da miostatina ou que receberam anticorpos anti-miostatina apresentaram melhora das alterações musculares; no entanto os camundongos velhos com a mesma forma da doença não apresentaram melhora quando tratados com anticorpos anti-miostatina. Este estudo sugere que a inibição da miostatina é útil somente no início da doença.

Australia - este grupo há algum tempo vem estudando o uso de oligonucleotídeos para corrigir o gene da distrofia muscular. Duas destas pesquisas foram publicadas esta semana, a primeira dela em cães e a segunda em camundongos com distrofia muscular. Utilizadando esta técnica em cães ele concluiu que é possível com este tratamento induzir uma grande e sustentada quantidade de distrofina  e que esta etapa é uma preparação para os experimentos em seres humanos. Na pesquisa em camundongos ele utilizou oligonucleotídeos polivalentes, para tratamento da distrofia muscular com mutações em exons diferentes. Isto facilitaria o tratamento em seres humanos e a conclusão deste trabalho é de que a técnica é possível.

Austrália - na distrofia muscular ocorre uma fibrose que esta relacionada a citocina TGF beta. Neste trabalho eles testaram a droga pirfenidona, que antagoniza o efeito da TGF beta, em camundongos com distrofia muscular. A droga foi administrada em solução na água que os camundongos ingeriam. Os animais tratados com pirfenidona em solução a 0,8 a 1,2% apresentaram redução da TGF beta e aumento da contratilidade do músculo cardíaco. Este estudo demonstrou que a droga pirfenidona  pode ser eficiente para retardar a evolução da doença cardíaca na distrofia muscular mas novos estudos precisam ser realizados.

Australia -  mástócitos são  uma grande fonte de mediadores de inflamação; neste estudo a droga cromoglicato dissódico, um inibidor da liberação de mediadores dos mástócitos foi administrada a camundongos com distrofia muscular. A administração de cromoglicato dissódico neste camundongos reduziu a necrose dos músculos. O resumo do artigo, em inglês, pode ser lido abaixo:

(IN PRESS: Neurobiology of the Disease, 2006) Cromolyn administration (to block mast cell degranulation) reduces necrosis of dystrophic muscle in mdx mice

Hannah G. Radley and Miranda D. Grounds - Australia

Duchenne muscular dystrophy  is a lethal muscle wasting disorder, resulting from mutations in the gene encoding for the skeletal muscle protein dystrophin. The absence of functional dystrophin leaves the muscle membrane vulnerable to damage during contraction. Damage initially occurs as ‘tears’ in the membrane, this damage can be exacerbated by the inflammatory response leading to myofibre necrosis rather than repair. Mast cells resident within skeletal muscle represent an immediate source of pro-inflammatory cytokines. We hypothesise that blockade of mast cell degranulation would reduce the extent of myofibre necrosis in the mdx mouse. Daily cromolyn injections were performed on young and exercised adult mdx mice and histological analysis confirmed that mast cell degranulation contributes to myofibre necrosis. This research identified high biological variation between individual mdx mice in the severity of the dystrophic pathology, and supported a relationship between extent of muscle damage in adult mdx mice and their individual enthusiasm for voluntary wheel running.
 

Itália - os autores descrevem a propriedade das células tronco do tecido adiposo em se transformar em tecido muscular. Estas células a fresco tem potencial em se transformar em células muscular expontaneamente. Se elas forem cultivadas com mioblastos este potencial aumenta, em especial se forem colocadas no mesmo recipiente. Alem disso em camundongos com distrofia muscular estas células tem a capacidade de regenerar as fibras musculares e restaurar a expressão da distrofina. O resumo em inglês do artigo pode ser lido abaixo:

(IN PRESS: J. Cell Sci., Jul 2006; 119: 2945 - 2952) Myogenic potential of adipose-tissue-derived cells

Giuliana Di Rocco, Maria Grazia Iachininoto, Alessandra Tritarelli, Stefania Straino, Antonella

Zacheo, Antonia Germani, Filippo Crea and Maurizio C. Capogrossi - Italy

Adipose-tissue-derived mesenchymal stem cells can be directed towards a myogenic phenotype in vitro by the addition of specific inductive media. However, the ability of these or other adipose-tissue-associated cells to respond to `natural' myogenic cues such as a myogenic environment has never been investigated in detail. Here, we provide evidence that a restricted subpopulation of freshly harvested adipose-tissue-derived cells possesses an intrinsic myogenic potential and can spontaneously differentiate into skeletal muscle. Conversion of adipose-tissue-derived cells to a myogenic phenotype is enhanced by co-culture with primary myoblasts in the absence of cell contact and is maximal when the two cell types are co-cultured in the same plate. Conversely, in vitro expanded adipose-tissuederived mesenchymal stem cells require direct contact with muscle cells to generate skeletal myotubes. Finally, we show that uncultured adipose-tissue-associated cells have a high regenerative capacity in vivo since they can be incorporated into muscle fibers following ischemia and can restore significantly dystrophin expression in mdx mice.

USA - neste estudo os pesquisadores administraram a camundongos com distrofia muscular um vetor viral por via intravascular carregando um microgene da distrofina. O tratamento restabeleceu a expressão do gene da distrofina nos músculos dos membros, no coração e no diafragma. As alterações patológicas se reduziram e houve aumento da sobrevida dos animais. Os comentários deste artigo também podem ser lidos aqui.

Itália - neste estudos os pesquisadores utilizaram camundongos deficientes em alfa-sarcoglicans, expressando uma forma de de distrofia tipo cinturas; eles injetaram nestes camundongos os  mesangioblastos que são células tronco de vasos sanguineos; os mesangioblastos foram previamente expostos a muitas substâncias antes de serem injetados nos camundongos; mais de 80% das fibras passaram a expressar a alfa-sarcoglican, com aumento superior a 5 vezes os animais do grupo controle. Este estudo define um modo de estimular estas células a se transformar em células musculares e com um resultado que permita corrigir as alterações degenerativas dos músculos.

Japão - a maioria dos estudos experimentais utiliza o camundongo mdx que é deficiente em distrofina; nesta pesquisa foram comparados os resultados do transplante de medula óssea em camundongos mdx e camundongos com uma forma de distrofia congênita (deficiência em laminina alfa 2). Os camundongos com distrofia muscular congênita tratados com transplante de medula óssea apresentaram maior taxa de crescimento, aumento de força muscular, melhora da função respiratória e maior sobrevida. Os camundongos mdx apresentaram expressão da distrofina em algumas fibras mas não tiveram nenhuma melhora com o tratamento. O resumo em inglês do artigo pode ser lido abaixo:

IN PRESS: FEBS, 2006 Bone marrow transplantation improves outcome in a mouse model of congenital muscular dystrophy

 Hiroki Hagiwaraa, Yutaka Ohsawaa, Shoji Asakurab, Tatsufumi Murakamia, Takanori Teshimac, Yoshihide Sunadaa - Japan

We examined whether pathogenesis in dystrophin-deficient (mdx) mice and laminin-a2-deficient (dy) mice is ameliorated by bone marrow transplantation (BMT). Green fluorescent protein (GFP) mice were used as donors. In mdx mice, BMT failed to produce any significant differences in muscle pathology, although some GFP-positive fibers with restored dystrophin expression were observed. In contrast, in the dy mice, BMT led to a significant increase in lifespan and an increase in growth rate, muscle strength, and respiratory function. We conclude that BMT improved outcome in dy mice but not mdx mice.

China - neste estudo os pesquisadores realizaram o transplante de medula óssea nos camundongos mdx (camundongos com mutação no gene da distrofina). Ao contrário do trabalho abaixo onde o resultado foi muito pequeno, neste estudo chinês houve expressão da distrofina progressivamente maior ao longo do tempo chegando até 16%.

USA - a distrofia miotônica é considerada a forma de distrofia mais frequente em adultos; neste estudos os autores utilizaram a terapia gênica em camundongos que apresentavam o mesmo defeito genético da distrofia miotônica do tipo 1. Eles injetaram na pata do camundongo o gene da proteína muscleblind-like 1 (MBNL1). Com esta terapia a miotonia, que é a incapacidade de relaxar, foi corrigida. Esta notícia pode ser lida em outros sites:

UF scientists reverse muscle contractions in mouse model of muscular dystrophy

UF scientists reverse muscle contractions in mouse model of muscular dystrophy

Austrália - aumentar a regeneração dos músculos é uma alternativa experimental para tratamento da distrofia muscular de Duchenne. Neste estuda a regeneração muscular com o uso do IGF-1, uma proteína presente no nosso organismo. Ela foi administrada a camundongos com lesão muscular de duas formas: no primeiro grupo foi administrada a própria proteína e no segundo grupo foi administrado o gene que faz a célula produzir IGF-1. A comparação dos resultados demonstrou que a administração do gene do IGF-1 promove regeneração maior que o observado com a administração da proteína diretamente.

USA - os pesquisadores utilizaram camundongos que apresentavam os sinais característicos da distrofia miotônica; eles conseguiram neutralizar o RNA dos animais e observaram regressão dos sintomas da doença, abrindo a possibilidade desta terapia ser testada na distrofia miotônica humana. Os comentários destes artigos podem ser lidos também nos links abaixo:

http://www.mdausa.org/research/060802rna_mmd.html

http://news.bbc.co.uk/1/hi/health/5223314.stm

São Paulo - " Cientistas da Universidade de São Paulo (USP) estão obtendo avanços importantes na pesquisa de células-tronco adultas (não embrionárias) obtidas de uma fonte pouco convencional: a gordura residual das técnicas de lipoaspiração em clínicas de cirurgia plástica. Em uma pesquisa realizada no Centro de Estudos do Genoma Humano, células-tronco do tecido adiposo foram transformadas em células musculares produtoras de distrofina, uma proteína essencial para pacientes com distrofia de Duchenne, doença genética que causa degeneração dos músculos. Segundo a pesquisadora Natássia Vieira, que faz o trabalho para sua tese de doutorado, as células-tronco do tecido adiposo podem ser tão versáteis quanto as da medula óssea - uma das fontes mais usadas em pesquisa. "Talvez sejam até mais. Estou tentando demonstrar isso." Em experimentos in vitro, as células-tronco da gordura se fundiram a células do músculo esquelético de pacientes. Portadores da distrofia de Duchenne não produzem distrofina, o que causa degradação da membrana que envolve as fibras musculares. "Sem essa capa protetora, as proteínas que deveriam estar dentro dos músculos vazam e a musculatura se degenera", explica a geneticista Mayana Zatz, que orienta a pesquisa. Ao se fundir com as células-tronco, porém, as células musculares dos pacientes passaram a produzir distrofina normalmente. "Os níveis de expressão foram compatíveis com os de uma pessoa saudável", disse Natássia. Os experimentos foram feitos apenas in vitro, e muitos estudos ainda são necessários até que a técnica possa ser testada clinicamente. "É apenas um primeiro passo, mas um passo importante", observa Mayana. Os próximos são testes in vivo com camundongos e cachorros. A idéia, futuramente, é que as células-tronco possam ser injetadas em portadores da doença para que seus músculos produzam distrofina. "O que a gente quer é substituir o músculo, como se fosse um transplante de órgão", compara Mayana. Segundo ela, há mais de 30 tipos de distrofias musculares - cada uma relativa a uma proteína diferente - que poderiam se beneficiar da mesma técnica. A pesquisa é feita em colaboração com a médica Vanessa Brandalise."
 

Bélgica - este congresso que ocorrerá em outubro de 2006 é o maior encontro de especialistas em doenças neuromusculares. Dos trabalhos que serão apresentados eu selecionei os que se relacionam às distrofias musculares em especial com aspectos de tratamento (são 29 trabalhos que eu selecionei). Há várias pesquisas com terapia gênica, corticóide, osteoporose mas muitas poucas pesquisas com drogas para uso imediato. A maioria dos trabalhos é experimental mas há vários sobre Duchenne.

Australia - a infiltração de células inflamatórias nos músculos é um dos mecanismos de degeneração dos músculos e piora da doença. Nesta pesquisa os autores avaliam o papel dos néutrófilos e do fator de necrose tumoral (TNF) na evolução da degeneração muscular.  Os camundongos com distrofia muscular foram tratados com etarnecept, um anticorpo bloqueador do TNF) ou receberam injeções de anticorpos para reduzir o número de neutrófilos no sangue. Houve uma significante redução da necrose muscular com ambos os tratamentos mas os resultados melhores foram conseguidos com o uso do etarnecept. Estes pesquisadores já estudaram em camundongos um outro inibidor do TNF o Remicade com ótimos resultados. Parece claro que em camundongos há uma melhora com o uso de inibidores de TNF e há necessidade de estudos em seres humanos para comprovar este efeito.

USA - ínumeros trabalhos confirmam que os cortícoides aumentam a força muscular em camundongos e pacientes com distrofia muscular de Duchenne. Nesta pesquisa os corticóides foram utilizados em camundongos com distrofia muscular apenas nos finais de semana (sábado e domingo) a partir da terceira ou quarta semana de vida. Os resultados demonstraram que este esquema de corticóides aumenta a força muscular nos camundongos e aumenta a sobrevida dos animais. Este é mais um trabalho demonstrando os efeitos a longo prazo dos corticóides na distrofia muscular de Duchenne.

Itália e Estados Unidos - neste estudos os pesquisadores estudaram três drogas: o ácido valpróico, fenilbutirato e tricostatin A; destas três drogas a triscostatin A (TSA), que é usada no tratamento do câncer,  foi a que apresentou melhor resultado. Estas drogas são inibidores da enzima deacetilase. Na distrofia muscular de camundongos a droga aumenta a expressão da folistatina, que causa aumento da fibra muscular antagonizando o efeito da miostatina. Além de reduzir de forma  importante as alterações patológicas dos músculos a droga também causou aumento da força da muscular. Além disso a droga foi utilizada em camundongos com três meses demonstrando efeito mesmo quando a degeneração muscular já tinha se manifestado. Esta é mais uma linha promissora de drogas para retardar a evolução da doença até que um tratamento definitivo possa surgir. O resumo em inglês do artigo pode ser lido abaixo:

(IN PRESS:NATURE MEDICINE, 2006) Functional and morphological recovery of dystrophic muscles in mice treated with deacetylase inhibitors

G C Minetti, C Colussi, R Adami, C Serra, C Mozzetta, V Parente, S Fortuni, S Straino, M Sampaolesi, M Di Padova, B Illi, P Gallinari, C Steinkühler, M C Capogrossi, V Sartorelli, R Bottinelli, C Gaetano & P L Puri - Italy and USA

Pharmacological interventions that increase myofiber size counter the functional decline of dystrophic muscles. We show that deacetylase inhibitors increase the size of myofibers in dystrophin-deficient (MDX) and alpha-sarcoglycan (alpha-SG)–deficient mice by inducing the expression of the myostatin antagonist follistatin in satellite cells. Deacetylase inhibitor treatment conferred on dystrophic muscles resistance to contraction-coupled degeneration and alleviated both morphological and functional consequences of the primary genetic defect. These results provide a rationale for using deacetylase inhibitors in the pharmacological therapy of muscular dystrophies

USA - o bioquímico alemão Guenter Scheuerbrandt dedica-se a fazer resumos sobre as pesquisas em distrofia muscular de Duchenne, procurando tornar as informações técnicas mais facilmente entendíveis pela população. Neste texto ele faz um resumo das apresentações que foram feitas no Encontro Anual do Parent Project americano, onde foram discutidas as pesquisas recentes para tratamento da doença. O texto em inglês podem ser copiados e utilizados por todos. Ele também tem um site com outras informações em inglês, espanhol e alemão.  O site dele pode ser acessado por aqui.

USA - o losartan é utilizado no tratamento da hipertensão arterial por inibir o receptor AT1 da angiotensina II. Neste estudo em camundongos a droga reduziu as alterações patológicas dos músculos e aumentou a força muscular em camundongos com distrofia muscular. O mecanismo para esta melhora seria a inibição da citocina TGF beta, causando aumento da capacidade regenerativa dos músculos. É um avanço interessante porque esta droga pode ser utilizada também na prevenção e tratamento das manifestações cardíacas da distrofia muscular de Duchenne, sendo uma droga já conhecida e aprovada para uso cardiológico em adultos e crianças. O resumo em inglês da pesquisa pode ser lido abaixo:

Angiotensin II Type 1 Receptor Blockade Improves TGFb-induced Failure of Muscle Regeneration in the mdx Mouse Model of Duchenne Muscular Dystrophy.

R.D. Cohn, J.P. Habashi, B.L. Loeys, E.C. Klein, M. Gamradt, T.M. Holm, D.P. Judge, H.C. Dietz USA

We have previously shown that increased TGFb activity causes abnormal muscle regeneration and myopathy in fibrillin-1 deficient mice, a model of Marfan syndrome. Systemic antagonism of TGFb via administration of TGFb-neutralizing antibody or the angiotensin II type 1 receptor (AT1) blocker losartan restores abnormal muscle regeneration and prevents subsequent development of myopathic features. Impaired satellite cell performance and muscle repair has also been shown to play a significant role in the disease progression of various forms of muscular dystrophy. Here we demonstrate that myopathic changes in the dystrophin-deficient mdx mouse model of Duchenne muscular dystrophy associates with excessive TGFb signaling, as evidenced by increased phosphorylation of pSmad2/3. Systemic TGFb antagonism via losartan improves the satellite cell response to toxin induced-injury in the mdx mouse. Losartan treated mdx mice have improved steady-state muscle architecture and a near-normal amount of actively regenerating, neonatal myosin positive fibers four days after induced injury. After 18 days, losartan-treated mdx mice show only minimal amount of fibrosis, as demonstrated by vimentin expression, when compared to placebo-treated mice. Moreover, long-term administration of losartan leads to improved functional performance as demonstrated by increased muscle grip strength and decreased muscle fatigue in mdx mice. Together, our data demonstrate that treatment with the FDA approved medication losartan attenuates TGFb-induced failure of muscle regeneration and represents a promising therapeutic strategy for the treatment of Duchenne muscular dystrophy. Given that losartan is widely used to treat hypertension and has an exceptional tolerance profile in all age groups, we propose that a clinical trial using losartan is warranted.

Inglaterra - as pesquisas para tratamento da distrofia muscular só avançarão com a pressão de pais e portadores da doença. Sem esta pressão as pesquisas continuarão sendo básicas, não voltadas para a atual e próxima geração de pacientes. A distrofia muscular é uma doença genética mas há vários mecanismos envolvidos na degeneração muscular: influxo de cálcio, infiltração por células inflamatórias, stress oxidativo, etc. Toda esta complexidade só pode ser resolvida com a reunião de pesquisadores capazes de sugerir soluções para todos estes mecanismos e não somente com a reunião de pesquisadores que entendam a doença como um mecanismo único, ou com uma visão limitada do problema. A presença dos pais e médicos com experiência na parte clínica é fundamental para tornar realidade as pesquisas em animais. Reunião a portas fechadas são improdutivas para esta geração de pacientes. Pesquisadores tem a sua própria agenda, totalmente diferente dos pais e clínicos. Como exemplo da capacidade dos pais em organizar um encontro de alto nível é o  encontro dos pais ingleses do Parent Project UK (http://www.ppuk.org). Eles reunirão importantes pesquisadores em todas as áreas: tratamento medicamentoso, genético, clínico etc. Entre os assuntos que serão apresentados estão: resultados do estudo clínico com PTC124, uso de oligonucleotídeos no coração, uso de drogas antioxidantes, estudo de oligonucleotídeos na Holanda (notícia abaixo), estudos para aumentar a expressão da utrofina. Em apenas dois dias, sem blá-blá de discursos serão discutidos assuntos que importam, e não o sexo dos anjos (ou dos camundongos). Um outro exemplo da decisão dos pais em empurrar os pesquisadores também será apresentado neste encontro. Um grupo de 16 pais decidiu testar um suplemento nutricional em seus próprios filhos.  Cada pai fez a sua própria avaliação e não houve contato entre eles durante o "experimento". Este suplemento reduziria o stress oxidativo e causou uma melhora em todas as crianças que fizeram uso. Este estudo, sem base científica nenhuma e cujas conclusões serão muito contestadas, demonstra que há muito por fazer e pesquisar. Além disso eles tem se empenhado em arrecadar dinheiro e vão investí-lo nas pesquisas que eles consideram mais promissoras. Espero que este exemplo britânico possa ser seguido por grupo de pais do mundo todo.

França - em um estudo teórico este artigo analisa a possibilidade de corrigir a distrofia muscular de Duchenne com oligonucleotídeos. O objetivo é transformar a distrofia de Duchenne em distrofia de Becker, fazendo com que o músculo produza alguma forma de distrofina. Em geral os pesquisadores constroem oligonucleotídeos para corrigir alguma mutação. Eles sugerem que oligonucleotídeos multiexon poderia corrigir mais de um tipo de mutação e permitir a correção de 63% dos casos da doença.

China -  esta pesquisa será apresentada no Encontro Anual da Sociedade Americana de Biologia Celular em dezembro. A curcumina é conhecida também como açafrão, um aditivo não tóxico acrescentado na alimentação. A curcumina inibe a  ativação da NF-kB que contribui para a degeneração muscular. Os animais tratados com curcumina apresentaram menor lesão muscular, além da redução da enzima CK, do fator de necrose tumoral, da interleucina 1 beta e da oxido nítrico sintetase induzida. O resumo em inglês da pesquisa pode ser lida abaixo:

Curcumin Attenuates Dystrophic Pathology in mdx Mice through Inhibiting NF-κB Activation
M. S. Zhu, C. Chen, Y. L. Hu, S. Chen - China

The dystrophin-glycoprotein complex has emerged as a scaffold responsible for the membrane docking of signaling proteins. There is no definitive cure available currently. In dystrophin-deficient muscular dystrophy, abnormal activation of signal pathways may play important roles in dystrophic pathogenesis. In this report, we found a natural botanical gradient, curcumin, capable of attenuating dystrophic pathology significantly and the mechanism underlying was involved in NF-κB inhibition. After treating X-linked muscular dystrophy (mdx) mice with 1 to 10 mg of curcumin, the sarcolemmic integrity assessed by Evans blue staining and muscle strength determined both by grip strength test and traction test were improved significantly. Histological analysis demonstrated that curcumin reduced severity of myofibril necrosis and extent of regenerating fibers as well as the variability in size of fibers. Creatine kinase level and the expressions of tumor necrosis factor alpha, interleukine-1 beta and inducible nitric oxide synthase were decreased also after curcumin treatment. Consistently, elevated NF-κB activity in muscle fibers of mdx mice decreased after curcumin administration. Since curcumin is a non-toxic compound derived from C.longa, which was widely used in healthy food. The possible effect of curcumin may be worth studying in Duchenne muscular dystrophy therapy.
(46th Annual Meeting American Society for Cell Biology - San Diego, December 2006)

Stem cell tests offer muscular dystrophy hope

Stem cells reverse muscular dystrophy

Itália e França - este é a primeira pesquisa que demonstra resultados expressivos usando as células tronco em cães com distrofia muscular; eles utilizaram mesangioblastos, células tronco de vasos que foram injetadas em artéria. Houve uma grande expressão da distrofina em vários músculos, inclusive no diafragma. Além disso houve melhora da força muscular e aumento da sobrevida. os resultados demonstram que este é um bom caminho para o tratamento de todas as formas de distrofia muscular, mas ainda há necessidade de novos estudos. O resumo em inglês do artigo pode ser lido abaixo:

(IN PRESS: Nature, 2006) Mesoangioblast stem cells ameliorate muscle function in dystrophic dogs

Maurilio Sampaolesi, Stephane Blot, Giuseppe D’Antona, Nicolas Granger, Rossana Tonlorenzi, Anna Innocenzi, Paolo Mognol, Jean-Laurent Thibaud, Beatriz G. Galvez, Ines Barthelemy, Laura Perani, Sara Mantero, Maria Guttinger, Orietta Pansarasa, Chiara Rinaldi, M. Gabriella Cusella De Angelis, Yvan Torrente, Claudio Bordignon, Roberto Bottinelli & Giulio Cossu - Italy and France

Duchenne muscular dystrophy remains an untreatable genetic disease that severely limits motility and life expectancy in affected children. The only animal model specifically reproducing the alterations in the dystrophin gene and the full spectrum of human pathology is the golden retriever dog model. Affected animals present a single mutation in intron 6, resulting in complete absence of the dystrophin protein, and early and severemuscle degeneration with nearly complete loss of motility and walking ability. Death usually occurs at about 1 year of age as a result of failure of respiratory muscles. Here we report that intra-arterial delivery of wild-type canine mesoangioblasts (vessel-associated stem cells) results in an extensive recovery of dystrophin expression, normal muscle morphology and function (confirmed by measurement of contraction force on single fibres). The outcome is a remarkable clinical amelioration and preservation of active motility. These data qualify mesoangioblasts as candidates for future stem cell therapy for Duchenne patients.

Australia - formoterol é uma droga utilizada rotineiramente no tratamento da asma; utilizada em baixas doses em camundongos causa hipertrofia muscular. Neste estudo doses baixas de formoterol foram adminstradas a camundongos com distrofia muscular. Os camundongos foram tratados por 10 semanas. Os animais apresentaram aumento da massa muscular; não houve aumento da fadiga muscular. Os resultados observaram demonstraram que o formoterol tem uma ação anabólica que poderia ser útil nos pacientes com distrofia muscular.

São Paulo - "Coordenadora do Centro de Estudos do Genoma Humano da Universidade de São Paulo (USP), um dos Cepids (Centros de Pesquisa, Inovação e Difusão) financiados pela FAPESP, a geneticista Mayana Zatz estuda há mais de duas décadas a biologia molecular das doenças neuromusculares, em especial da distrofia de Duchenne, que atinge um em cada 2 mil nascidos vivos. Nesta entrevista, Mayana, que também é fundadora e diretora presidente da Associação Brasileira de Distrofia Muscular, comenta os resultados animadores da tentativa de terapia celular relatada na revista Nature pelo grupo italiano e fala dos experimentos, também com células-tronco adultas, que seu grupo conduz na USP com cachorros que sofrem de distrofia.

Como a senhora analisa os efeitos dos tratamentos propostos no artigo da Nature?
Embora ainda modestos, os resultados sugerem que o tratamento da distrofia de Duchenne, ou de outras formas de distrofia, por meio do transplante de células-tronco adultas heterólogas, obtidas de um doador sadio, poderá ser possível. A ocorrência nos cães de uma reação imunológica modesta (ou seja, a rejeição ao material biológico externo transplantado não foi violenta) indica que talvez não seja necessário manter o sistema imunológico dos animais deprimido durante toda a sua vida. Parece ser possível recorrer à imunossupressão de forma leve e apenas temporária. Isso é um aspecto positivo dessa abordagem. O trabalho publicado reforça a idéia de que estamos no caminho certo e que talvez experiências com humanos possam ser realizadas antes do esperado.  É, sem dúvida, uma luz muito importante no fim do túnel!

No experimento dos italianos, o transplante de células-troncos adultas dos próprios animais doentes, só que modificadas por um tipo de terapia gênica, não deu os mesmos resultados que o uso de células heterólogas, de doadores sadios. A senhora acredita mais na viabilidade dessa segunda abordagem?
Pessoalmente, acho que o transplante heterólogo vai ser melhor. Além de ser mais fácil, vai permitir que se trate todas os tipos de distrofia e não só a de  Duchenne. No caso do transplante autólogo, que é uma combinação de terapia gênica e terapia celular, não houve melhora clínica e os animais tratados perderam progressivamente a capacidade para andar.  Como o gene da distrofina, é gigantesco  – tem mais de 2 milhões de pares de bases – os pesquisadores italianos inseriram nos mesangioblastos (um tipo de célula-tronco) um micro-gene da distrofina  no qual são mantidas as partes fundamentais para que ele continue funcional. Mas essa abordagem, além de ser mais difícil de ser executada,  não deu bons resultados.

A senhora acha que os resultados do estudo italiano são os mais promissores até agora obtidos por grupos de pesquisa que trabalham com distrofia muscular?
Diria que sim, porque o experimento deles é o mais próximo do que poderemos fazer com seres humanos.

Existem pesquisas semelhantes às dos italianos sendo realizadas no Brasil?
Nosso grupo, no Centro de Estudos do Genoma Humano (um dos dez Cepids financiados pela FAPESP), também tem trabalhado com cães da raça golden retriever com distrofia em  colaboração com o grupo da Dra.Maria Angélica Miglino, da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da USP e com os doutores Irina Kerkis e Alexandre Kerkis, do Instituto Butantan. No momento, estamos submetendo 8 cães com distrofia a tratamentos com diferentes tipos de células-tronco  e mantemos 7 cães doentes como grupo de controle, sem receber nenhum tipo de terapia. Alguns dos nossos animais também receberam imunossupressão  leve e por pouco tempo. Outros não receberam nenhuma imunossupressão e não tiveram reação. Isso é muito positivo. Diferentemente dos italianos, não pretendemos sacrificar nenhum animal. Ao contrário, queremos que eles vivam muito. Portanto, nossa experiência pessoal permite uma análise profunda do trabalho dos italianos. Alguns aspectos do estudo deles nos chamaram a atenção. O primeiro foi a caracterização dos cães com distrofia. De acordo com a descrição publicada na Nature, os cães italianos   morrem geralmente no primeiro ano de vida e perdem quase completamente a mobilidade e a capacidade para andar. Isso, no entanto, não aconteceu com nenhum dos oito machos de nosso canil, algo surpreendente porque todos eles possuem a mesma mutação.

As manifestações clínicas da distrofia nos seus cães diferem muito das relatadas pelo grupo da Itália?
Nos nossos cães, a distrofia apresenta uma grande variabilidade clínica: alguns animais afetados pela doença morrem nos primeiros dias ou semanas de vida enquanto outros podem sobreviver alguns anos e serem pouco afetados. Temos dois machos que, apesar de portadores da mutação, são tão pouco afetados clinicamente que recentemente puderam se tornar pais. cruzaram naturalmente com as fêmeas. Diferentemente do grupo italiano, nenhum dos machos afetados de nosso canil que chegou à idade adulta perdeu a capacidade de andar.  Essa grande variabilidade clínica torna difícil avaliar os efeitos reais de um tratamento. Será que os animais estão melhores porque foram tratados ou porque existem outros genes ou fatores naturais que os protegem dos efeitos deletérios da mutação?

Seu grupo já publicou algum trabalho com os resultados dos experimentos com cães?
Ainda não publicamos nada, mas só trabalhamos com células heterólogas, de doadores sadios. Estamos usando outros tipos de células-tronco adultas, principalmente as mesenquimais, um tipo de célula-tronco que retiramos do cordão umbilical  e também de outros tecidos. Mas há algumas questões para as quais ainda não temos resposta. Por exemplo, ninguém sabe quantos transplantes de células-tronco serão necessários para obter algum efeito. Em nosso primeiro experimento, demos uma dose única para ver o que acontece, mas ainda estamos analisando os resultados. Também não sabemos qual é a melhor via de injeção nem qual deve ser o  intervalo entre as doses. Outro ponto em aberto é quando devemos começar o tratamento.

É possível avaliar se estamos a anos ou décadas de um tratamento efetivo para as distrofias?
Acho que estamos a anos, talvez menos tempo do que se imagina. De qualquer modo,  vai ser importante acompanhar esses cães a longo prazo."

Itália - ácidos graxos alfa 3 poliinsaturados reduzem o risco de doença isquêmica cardíaca mas não haviam sido testados em doença genética cardíaca. Neste estudo o ácido alfa linolênico foi administrado a hamsters com distrofia muscular por deficiência de delta sarcoglicans. Houve redução das alterações patológicas do músculo cardíaco e aumento da sobrevida destes animais. Isto demonstra que o ácido alfa linolênico pode retardar as alterações cardíacas nas distrofias musculares. O resumo do artigo em inglês está abaixo:

Alpha-Linolenic Acid-Enriched Diet Prevents Myocardial Damage and Expands Longevity in Cardiomyopathic Hamsters

Roberta Fiaccavento, Felicia Carotenuto,Marilena Minieri, Laura Masuelli, Alba Vecchini, Roberto Bei, Andrea Modesti, Luciano Binaglia, Angelo Fusco, Aldo Bertoli, Giancarlo Forte, Luciana Carosella, and Paolo Di Nardo  -  Italy

(Am J Pathol 2006, 169:1913–1924)

Randomized clinical trials have demonstrated that the increased intake of alpha-3 polyunsaturated fatty acids significantly reduces the risk of ischemic cardiovascular disease, but no investigations have been performed in hereditary cardiomyopathies with diffusely damaged myocardium. In the present study, -delta-sarcoglycan- null cardiomyopathic hamsters were fed from weaning to death with an alpha-linolenic acid (ALA)-enriched versus standard diet. Results demonstrated a great accumulation of ALA and eicosapentaenoic acid and an increased  eicosapentaenoic/arachidonic acid ratio in cardiomyopathic hamster hearts, correlating with the preservation of myocardial structure and function. In fact, ALA administration preserved plasmalemma and mitochondrial membrane integrity, thus maintaining proper cell/extracellular matrix contacts and signaling, as well as a normal gene expression profile (myosin heavy chain isoforms, atrial natriuretic peptide, transforming growth factor-beta1) and a limited extension of fibrotic areas within ALA-fed cardiomyopathic hearts. Consequently, hemodynamic indexes were safeguarded, and more than 60% of ALA-fed animals were still alive (mean survival time, 293+141.8 days) when all those fed with standard diet were deceased (mean survival time, 175.9 + 56 days). Therefore, the clinically evident beneficial effects of alpha-3 polyunsaturated fatty acids are mainly related to preservation of myocardium structure and function and the attenuation of myocardial fibrosis.

Itália -  esta pesquisa é do mesmo grupo que recentemente demonstrou em cães bons resultados com o uso de mesangioblastos para tratamento da distrofia muscular. Neste estudo em camundongos os mesangioblastos foram tratados previamente, antes da injeção, com doadores de óxido nítrico. Estas células tratadas foram mais eficientes para tratamento da distrofia muscular do que as células não tratadas. O resumo em inglês desta pesquisa pode ser lido abaixo:

(IN PRESS: Journal of Cell Science 2006; 119: 5114-5123) Ex vivo treatment with nitric oxide increases mesoangioblast therapeutic efficacy in muscular dystrophy 

Clara Sciorati, Beatriz G. Galvez, Silvia Brunelli, Enrico Tagliafico, Stefano Ferrari, Giulio Cossuand Emilio Clementi - Italy

Muscular dystrophies are characterized by primary wasting of skeletal muscle for which no satisfactory therapy is available. Studies in animal models have shown that stem cell-based therapies may improve the outcome of the disease, and that mesoangioblasts are promising stem cells in this respect. The efficacy of mesoangioblasts in yielding extensive muscle repair is, however, still limited. We found that mesoangioblasts treated with nitric oxide (NO) donors and injected intra-arterially in {alpha}-sarcoglycan-null dystrophic mice have a significantly enhanced ability to migrate to dystrophic muscles, to resist their apoptogenic environment and engraft into them, yielding a significant recovery of {alpha}-sarcolgycan expression. In vitro NO-treated mesoangioblasts displayed an enhanced chemotactic response to myotubes, cytokines and growth factors generated by the dystrophic muscle. In addition, they displayed an increased ability to fuse with myotubes and differentiating myoblasts and to survive when exposed to cytotoxic stimuli similar to those present in the dystrophic muscle. All the effects of NO were cyclic GMP-dependent since they were mimicked by treatment with the membrane permeant cyclic-GMP analogue 8-bromo-cGMP and prevented by inhibiting guanylate cyclase. We conclude that NO donors exert multiple beneficial effects on mesoangioblasts that may be used to increase their efficacy in cell therapy of muscular dystrophies.

São Paulo - uma das formas promissoras para tratamento da distrofia muscular é a utilização da células tronco. Um dos problemas ainda não solucionados é como fazer as células tronco se diferenciar no tecido que precisamos, no caso músculos. Nesta pesquisa  realizada pela equipe da Dra. Mayana Zatz as células tronco cultivadas em laboratório puderam se diferenciar em músculos  e produzir distrofina após serem implantadas em camundongos com distrofia muscular e novamente cultivadas em laboratório. Isto demonstra mais uma vez que existem em nosso organismo citocinas que podem orientar a diferenciação das células tronco. A identificação clara destas citocinas permitirá que as células tronco possam ser utilizadas no tratamento das distrofias musculares.

Itália - o mesmo grupo italiano que descreveu bons resultados com células tronco em camundongos e cães realizou esta pesquisa associando uma droga nova com a terapai com células tronco. A droga nova é chamada de HCT 1026, um anti-inflaamatório derivado do flurbiproen e que libera óxido nítrico. É auma droga segura com poucos efeitos colaterais paara o estômago e tolerada para tratamento a longo prazo. A droga foi administrada por um ano a camundongos, em dois modelos de distrofia, camundongo mdx, sem distrofina, e o camundongo sem a proteína alfa sarcoglican. Houve melhora das alterações dos músculos, dos níveis de CK e da fadiga muscular com retardo da evolução da doença. os resultados nos camundongos foram melhores que os obtidos com corticóides. Os camundongos tratados com HCT 1026 e que receberam células tronco tiveram quatro vezes mais células tronco mugrando para os músculos. Este tratamento experimental com HCT 1026 demonstrou ser muito eficiente, com resultados positivos a longo prazo. O resumo do artigo e as informações adicionais, em inglês, podem ser lido abaixo:

(IN PRESS: PNAS 2007, 104(1):264-9) Nitric oxide release combined with nonsteroidal antiinflammatory activity prevents muscular dystrophy pathology and enhances stem cell therapy

Silvia Brunelli, Clara Sciorati, Giuseppe D’Antona, Anna Innocenzi, Diego Covarello, Beatriz G. Galvez, Cristiana Perrotta, Angela Monopoli, Francesca Sanvito, Roberto Bottinelli, Ennio Ongini, Giulio Cossu and Emilio Clementi - Italy

Duchenne muscular dystrophy is a relatively common disease that affects skeletal muscle, leading to progressive paralysis and death. There is currently no resolutive therapy. We have developed a treatment in which we combined the effects of nitric oxide with nonsteroidal antiinflammatory activity by using HCT 1026, a nitric oxide-releasing derivative of flurbiprofen. Here, we report the results of long-term (1-year) oral treatment with HCT 1026 of two murine models for limb girdle and Duchenne muscular dystrophies (alpha-sarcoglycan-null and mdx mice). In both models, HCT 1026 significantly ameliorated the morphological, biochemical, and functional phenotype in the absence of secondary effects, efficiently slowing down disease progression. HCT 1026 acted by reducing inflammation, preventing muscle damage, and preserving the number and function of satellite cells. HCT 1026 was significantly more effective than the corticosteroid prednisolone, which was analyzed in parallel. As an additional beneficial effect, HCT 1026 enhanced the therapeutic efficacy of arterially delivered donor stem cells, by increasing 4-fold their ability to migrate and reconstitute muscle fibers. The therapeutic strategy we propose is not selective for a subset of mutations; it provides ground for immediate clinical experimentation with HCT 1026 alone, which is approved for use in humans; and it sets the stage for combined therapies with donor or autologous, genetically corrected stem cells.

ADDITIONAL INFORMATIONS:

"HCT 1026, a derivative of flurbiprofen, one of the most potent nonsteroidal antiinflammatory drugs, that releases NO and does not have the severe side effects of corticosteroids. Of importance for an immediate testing in the clinic is the fact that HCT 1026 is safe at the gastrointestinal level, and it has been approved for use in humans; it is effective on oral administration, and it is thus suited for long-term treatment."

"Two decades after the identification of the molecular defect responsible for Duchenne muscular dystrophy, there are still no effective cures for the disease. The failure of all previous pharmacological treatments has left corticosteroids as the only available drug treatment. Therapy with corticosteroids, despite current attempts to ameliorate the protocols of administration, is still of limited clinical benefits, and it is accompanied by severe side effects. The treatment we tested here meets several criteria for an effective therapy, including the ability to block or at least significantly delay the progress of the disease, produce little or no side toxicity, be cost-effective, and, eventually, resolve the underlying genetic defect. In particular, the administration of HCT 1026 was sufficient on its own to delay significantly and persistently the progression of muscular dystrophy in two different models relevant to muscular dystrophy in humans. The drug was effective in correcting biochemical and morphological alterations and in limiting inflammation. Most importantly, the drug increased muscle strength and significantly increased the ability of animals to perform on different motility tests. This functional amelioration was persistent after 12 months of treatment, when disease in untreated animal was severe, clearly demonstrating the efficacy of the treatment in slowing disease progression. Long-term beneficial effects have not been reported for any of the experimental treatments of muscular dystrophy investigated so far."

USA - neste estudo realizado os autores injetaram vírus contendo o gene da distrofina no músculo de cães (dois tipos de vírus); ao contrário do que os autores observaram em camundongos os cães apresentaram uma reação imunológica a injeção do vírus. Se estes resultados se confirmarem em outros estudos esta modalidade de tratamento precisará obrigatoriamente ser acompanhada de drogas que reduzem a imunidade.

França - os pesquisadores utilizaram camundongos com deficiência em alfa-sarcoglican (com defeito semelhante a uma forma de distrofia muscular tipo cintura). Estes animais receberam vetor viral com o gene alfa-sarcoglican. Os animais tratados apresentaram melhora da força muscular e redução das alterações musculares, demonstrando que esta forma de tratamento pode ser útil no tratamento das distrofias tipo cintura.

Alemanha - o Dr Guenter Scheuerbrandt é um bioquímico aposentado que prepara resumos das pesquisas mais recentes, procurando explicá-las do modo mais simples possível. Este relatório inclui as últimas pesquisas do ano, mas no momento ele só foi publicado em inglês.

Este ano eu inclui neste site muitas pesquisas com células tronco, terapia gênica, medicamentos, etc. Analisando retrospectivamente estas pesquisas eu selecionei as dez mais promissoras linhas de pesquisa em tratamento medicamentoso da distrofia muscular de Duchenne. Em minha opinião o tratamento farmacológico é o que pode promover resultados mais imediatos no tratamento da doença até que um tratamento definitivo seja encontrado. Inclui também as pesquisas com suplementos, as pesquisas com os corticóides  e as pesquisas para tratamento das manifestações cardíacas da doença. Uma analise mais detalhada desta lista, que é meramente uma opinião pessoal, mostrará que a maioria das pesquisas com drogas estão sendo feitas fora dos Estados Unidos, em especial na Itália e Austrália.

USA - assim como eu relacionei as pesquisas com drogas mais promissoras de 2007 o Parent Project divulgou as pesquisas mais promissoras com terapia gênica e células tronco de 2006. Muitas destas pesquisas já estão sendo feitas em número pequenos de pacientes e também se espera para 2007 um grande número de estudos clínicos com oligonucleotídeos em pacientes com distrofia muscular de Duchenne.

USA - pela primeira vez as entidades MDA-USA (Associação Americana de Distrofia Muscular), Parent Project USA, AFM (Associação Francesa contra as miopatias) e a PPUMD (United Parents Projects Muscular Dystrophy) irão unir os esforços para a pesquisa de tratamentos e cura da distrofia muscular de Duchenne. Elas formarão um consórcio que irá direcionar as verbas, organizar pesquisas e pesquisadores para buscar uma cura para a doença. Entre os objetivos desta coalização está a realização de um cadastro mundial de todos os doentes, gestões políticas para obter verbas que serão direcionadas para tratamento e organização de protocolos clínicos.

 

Canadá - este grupo de pesquisa estuda o tratamento da distrofia muscular de Duchenne com mioblastos. Nesta pesquisa os mioblastos de um paciente com distrofia muscular de Duchenne foram tratados em laboratório com vetor viral carregando gene. Estes mioblastos submetidos ao tratamento foram injetados em macacos e se observou a expressão da distrofina, demonstrando a viabilidade deste

USA - esta pesquisa já tinha sido divulgada previamente em outubro de 2006 neste site. Os autores estudaram a droga Losartan, um medicamento comumente usado em doenças cardíacas e hipertensão arterial, que inibe a angiotensina II.  Eles demonstraram em camundongos que o losartan inibe a TGF beta e com isto aumenta a regeneração muscular, reduzindo as alterações dos músculos distróficos e aumentando a função muscular. No trabalho atual eles explicam em detalhes o resultado e mostram uma explicação para o efeito do losartan no músculo distrófico. Esta é uma droga promissora a ser estudada na distrofia muscular. O resumo em inglês do artigo pode ser lido abaixo:

(In Press: Nature Medicine, 2007) Angiotensin II type 1 receptor blockade attenuates TGF-beta–induced failure of muscle regeneration in multiple myopathic states

Ronald D Cohn, Christel van Erp, Jennifer P Habashi, Arshia A Soleimani, Erin C Klein, Matthew T Lisi, Matthew Gamradt, Colette M ap Rhys, Tammy M Holm, Bart L Loeys, Francesco Ramirez, Daniel P Judge, Christopher W Ward & Harry C Dietz - USA

Skeletal muscle has the ability to achieve rapid repair in response to injury or disease. Many individuals with Marfan syndrome (MFS), caused by a deficiency of extracellular fibrillin-1, exhibit myopathy and often are unable to increase muscle mass despite physical exercise. Evidence suggests that selected manifestations of MFS reflect excessive signaling by transforming growth factor (TGF)-beta. TGF-beta is a known inhibitor of terminal differentiation of cultured myoblasts; however, the functional contribution of TGF-beta signaling to disease pathogenesis in various inherited myopathic states in vivo remains unknown. Here we show that increased TGF-beta activity leads to failed muscle regeneration in fibrillin-1– deficient mice. Systemic antagonism of TGF-beta through administration of TGF-beta–neutralizing antibody or the angiotensin II type 1 receptor blocker losartan normalizes muscle architecture, repair and function in vivo. Moreover, we show TGF-beta–induced failure of muscle regeneration and a similar therapeutic response in a dystrophin-deficient mouse model of Duchenne muscular dystrophy.

França -  camundongos com distrofia muscular foram tratados por duas semanas com ácido alfa lipóico/carnitina, substâncias antioxidantes. Os animais tratados apresentaram redução dos níveis da enzima CK, dos produtos de peroxidação de lipídeos e da atividade enzimática antioxidante. Os autores discutem os mecanismos envolvidos nos efeitos benéficos deste tratamento.

USA - o maior problema da terapia gênica na distrofia muscular é a chegada dos vírus a todos os músculos e a correção do defeito da maioria das células musculares. Nesta pesquisa os autores criaram um vetor viral para transportar o gene da distrofina. A injeção do vetor viral em camundongos com distrofia muscular causou expressão do gene em grande quantidade de células musculares demonstrando a viabilidade desta terapia para tratamento das distrofias musculares

Itália - camundongos com distrofia muscular submetidos a exercícios foram tratados com etanercept, um anticorpo inibidor do TNF alfa ou com meloxicam, um anti-inflamatório não hormonal. Foram feitos estudos da força muscular, das alterações patológicas dos músculos e dosagem da CK sérica. Houve melhora funcional e da fibrose muscular nos animais tratados com etanercept e não nos tratados com meloxicam. O trabalho comprova que o uso do etanercept poderia ser útil no tratamento da distrofia muscular de Duchenne. O resumo em inglês do artigo pode ser lido abaixo:

In Press: Neuropathology and Applied Neurobiology, 2007) Role of tumour necrosis factor alpha, but not of cyclo-oxygenase-2-derived eicosanoids, on functional and morphological indices of dystrophic progression in mdx mice: a pharmacological approach

S. Pierno, B. Nico, R. Burdi, A. Liantonio, M. P. Didonna, V. Cippone, B. Fraysse, J.-F. Rolland, D. Mangieri, Andreetta, P. Ferro, C. Camerino, A. Zallone, P. Confalonieri and A. De Luca

The role of tumour necrosis factor (TNF)-alpha or cyclooxygenase- 2 (COX-2) eicosanoids in dystrophinopathies has been evaluated by chronically treating (4–8 weeks) adult dystrophic mdx mice with the anti-TNF-alpha etanercept (0.5 mg/kg) or the COX-2 inhibitor meloxicam (0.2 mg/kg). Throughout the treatment period the mdx mice underwent a protocol of exercise on treadmill in order to worsen the pathology progression; gastrocnemious muscles from exercised mdx mice showed an intense staining for TNF-alpha by immunohistochemistry. In vivo, etanercept, but not meloxicam, contrasted the exercise induced forelimb force drop. Electrophysiological recordings ex vivo, showed that etanercept counteracted the decrease in chloride channel function (gCl), a functional index of myofibre damage, in both diaphragm and extensor digitorum longus (EDL) muscle, meloxicam being effective only in EDL muscle. None of the drugs ameliorated calcium homeostasis detected by electrophysiology and/or spectrofluorimetry. Etanercept, more meloxicam, effectively reduced plasma creatine (CK). Etanercept-treated muscles showed a reduction connective tissue area and of pro-fibrotic cytokine vs. untreated ones; however, the histological profile weakly ameliorated. In order to better evaluate the of etanercept treatment on histology, a 4-week treatment was performed on 2-week-old mdx mice, so to match first spontaneous degeneration cycle. The histology of gastrocnemious was significantly improved reduction of degenerating area; however, CK levels only slightly lower. The present results support a key of TNF-alpha, but not of COX-2 products, in different phases dystrophic progression. Anti-TNF-alpha drugs may be in combined therapies for Duchenne patients.

China  -  os pesquisadores construiram um vetor viral para levar o microgene da distrofina, uma parte do gene que pode exercer a mesma função do gene inteiro. O vetor foi utilizado para tratamento das células mesenquimais dos camundongos com distrofia muscular. Os resultados demonstraram que este vetor  foi capaz de tratar as células mesenquimais dos camundongos. Se isto se confirmar em seres humanos será possível obter células de portadores de distrofia muscular e tratá-las em laborátorio. Quando injetadas estas células poderiam corrigir a doença. O resumo do artigo em inglês pode ser lido abaixo:

Chinese Journal of Biotechnology, 2007; 23(1):27-32) Construction of Recombinant Adenovirus Including Microdystrophin and Expression in the Mesenchymal Cells of mdx Mice

Fu XIONG, Cheng ZHANG, Shao-Bo XIAO, Mei-Shan LI, Shu-Hui WANG, Mei-Juan YU and Yan-Chang SHANG

Construction of recombinant adenovirus, which contain human microdystrophin, and then transfection into mesenchymal cells (MSCs) of mdx mice were done, and genetically-corrected isogenic MSCs were acquired; the MSCs transplantation into the mdx mice was then done to treat the Duchenne muscular dystrophy (DMD). Microdystrophin cDNA was obtained from recombinant plasmid pBSK-MICRO digested with restrictive endonuclease Not I; the production was inserted directionally into pShuttle-CMV. The plasmid of pShuttle-CMV-MICRO was digested by Pme I, and the fragment containing microdystrophin was reclaimed and transfected into E. coli BJ5183 with plasmid pAdeasy-1. After screening by selected media, the extracted plasmid of positive bacteria was transfected into HEK293 cells with liposome and was identified by observing the CPE of cells and by the PCR method. Finally, MSCs of mdx mice were infected with the culture media containing recombinant adenovirus, and the expression of microdystrophin was detected by RT-PCR and immunocytochemistry. Recombinant adenovirus including microdystrophin was constructed successfully and the titer of recombinant adenovirus was about 5.58 × 1012 vp/mL. The recombinant adenovirus could infect MSC of mdx mice and microdystrophin could be expressed in the MSC of mdx mice. Recombinant adenovirus including microdystrophin was constructed successfully, and the microdystrophin was expressed in the MSC of mdx mice. This lays the foundation for the further study of microdystrophin as a target gene to correct the dystrophin-defected MSC for stem cell transplantation to cure DMD.

Itália - este grupo de pesquisadores já tinha demonstrado que células de vasos sanguíneos de cães e camundongos podem gerar células musculares produtoras de distrofina. Neste experimento células tronco de microvasos sanguíneos foram injetadas em camundongos e estes animais passaram a expressar a distrofina, proteína que estava ausente. Estas células tronco de vasos de portadores de distrofia muscular de Duchenne se forem tratadas em laboratório com vetores virais podem fazer o músculo voltar a produzir distrofina. O resumo em inglês do artigo pode ser lido abaixo:

(Nature Cell Biology , 2007)  Pericytes of human skeletal muscle are myogenic precursors distinct from satellite cells

Arianna Dellavalle,  Maurilio Sampaolesi, Rossana Tonlorenzi, Enrico Tagliafico, Benedetto Sacchetti, Laura Perani, Anna Innocenzi, Beatriz G. Galvez, Graziella Messina, Roberta Morosetti, Sheng Li, Marzia Belicchi, Giuseppe Peretti, Jeffrey S. Chamberlain, Woodring E. Wright, Yvan Torrente, Stefano Ferrari, Paolo Bianco and Giulio Cossu - Italy

Cells derived from blood vessels of human skeletal muscle can regenerate skeletal muscle, similarly to embryonic mesoangioblasts. However, adult cells do not express endothelial markers, but instead express markers of pericytes, such as NG2 proteoglycan and alkaline phosphatase (ALP), and can be prospectively isolated from freshly dissociated ALP+ cells. Unlike canonical myogenic precursors (satellite cells), pericytederived cells express myogenic markers only in differentiated myotubes, which they form spontaneously with high efficiency. When transplanted into severe combined immune deficient–Xlinked, mouse muscular dystrophy (scid–mdx) mice, pericytederived cells colonize host muscle and generate numerous fibres expressing human dystrophin. Similar cells isolated from Duchenne patients, and engineered to express human minidystrophin, also give rise to many dystrophin-positive fibres in vivo. These data show that myogenic precursors, distinct from satellite cells, are associated with microvascular walls in the human skeletal muscle, may represent a correlate of embryonic ‘mesoangioblasts’ present after birth and may be a promising candidate for future cell-therapy protocols in patients.

Austrália e Reino Unido -  nesta revisão os autores discutem o uso de células tronco no tratamento das distrofias musculares e questionam as analises feitas das últimas pesquisas recentemente publicadas. Como nestas últimas pesquisas realizadas na Itália com células tronco os animais receberam drogas imunossupressoras os autores discutem se o bom resultado obtido não pode ter ocorrido pela medicação e não pelo uso das células tronco. O resumo em inglês do artigo pode ser lido abaixo:

(Neuromuscular Disorders, 2007) The allure of stem cell therapy for muscular dystrophy

Miranda D. Grounds , Kay E. Davies  - Australia and UK

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a lethal muscle disease for which an effective treatment is urgently needed. The use of stem cells to produce normal muscle cells to replace the missing dystrophin protein has attracted much attention. Claims of success using stem cell treatment in animal models of human muscle diseases require careful evaluation and are not necessarily easily extrapolated to the clinical situation. Recent studies in the dystrophic dog model have been claimed to show that injected mesangioblasts, stem cells derived from blood vessels, reduce the severity of the disease. However, the authors’ interpretation of the results did not consider that benefits might arise from the concomitant use of immunosuppressive drugs alone.

Japão - nesta pesquisa os autores demonstram que no sangue menstrual existem células com potencial de reparação dos músculos distróficos. Camundongos mantidos com imunossupressão receberam células derivadas do sangue menstrual; após o tratamento os músculos passaram a expressar a distrofina.

USA -  poloxamer 188 é uma substância com capacidade de proteger membranas celulares; funcionaria como um "cimento" na prevenção de lesões das células. Pesquisas prévias tinham demonstrado que a droga tinha efeito preventivo sobre as lesões do coração na distrofia muscular. Nesta pesquisa em camundongos com distrofia muscular a droga não protegeu a membrana muscular dos animais contra a lesão provocada por exercício intensivo.

Austrália - a estreptomicina é uma antíbiótico que é  usado no tratamento da tuberculose. Ela foi estudada em camundongos para avaliar o papel dos receptores SACs (stretch-activated channels) na distrofia muscular. Estreptomicina é uma droga bloqueadora dos receptores SACs. A estreptomicina aumenta a força muscular e reduz a lesão muscular dos animais, demonstrando que os receptores SACs podem estar envolvidos na agressão muscular da distrofia muscular

China - esta é mais uma pesquisa do Dr. Zhang já citado inúmeras vezes por aqui por suas pesquisas pioneiras, que infelizmente nem sempre são aceitas aqui no ocidente pela dificuldade de comprovação. Neste estudo foi construído um vetor viral portando o microgene da distrofina capaz de produzir o mesmo efeito que um gene inteiro. Este vírus foi usado para tratamento de células tronco de camundongos com distrofia muscular. Segundo o resumo apresentado os resultados foram bons apesar de não haver detalhes da intensidade desta melhora.

USA - entender como ocorre a degeneração muscular é uma etapa importante para o desenvolvimento de tratamentos para as distrofias musculares. Nesta pesquisa os autores demonstram claramente o papel da NF-kB na degeneração dos músculos e que a sua inibição poderia melhorar os sintomas das distrofias musculares. Drogas já estão em desenvolvimento para inibir a NF-kB, no entanto, nesta pesquisa os autores deixam claro que esta inibição tem que ser específica e controlada, já que a NF-kB é importante para a defesa do organismo contra infecções. O peptídeo NBD que foi usado nesta pesquisa não demonstrou até o momento em camundongos efeitos colaterais graves como os inibidores inespecíficos e prolongados da NF-kB. O resumo em inglês e a discussão do assunto feita pelos autores pode ser lida abaixo:

(J. Clin. Invest,2007) Interplay of IKK/NF-{kappa}B signaling in macrophages and myofibers promotes muscle degeneration in Duchenne muscular dystrophy

Swarnali Acharyya, S. Armando Villalta, Nadine Bakkar, Tepmanas Bupha-Intr, Paul M.L. Janssen, Micheal Carathers, Zhi-Wei Li, Amer A. Beg, Sankar Ghosh, Zarife Sahenk, Michael Weinstein, Katherine L. Gardner, Jill A. Rafael-Fortney, Michael Karin, James G. Tidball, Albert S. Baldwin and Denis C. Guttridge -USA

Duchenne muscular dystrophy (DMD) is a lethal X-linked disorder associated with dystrophin deficiency that results in chronic inflammation and severe skeletal muscle degeneration. In DMD mouse models and patients, we find that IB kinase/NF-B (IKK/NF-B) signaling is persistently elevated in immune cells and regenerative muscle fibers. Ablation of 1 allele of the p65 subunit of NF-B was sufficient to improve pathology in mdx mice, a model of DMD. In addition, conditional deletion of IKKß in mdx mice elucidated that NF-B functions in activated macrophages to promote inflammation and muscle necrosis and in skeletal muscle fibers to limit regeneration through the inhibition of muscle progenitor cells. Furthermore, specific pharmacological inhibition of IKK resulted in improved pathology and muscle function in mdx mice. Collectively, these results underscore the critical role of NF-B in the progression of muscular dystrophy and suggest the IKK/NF-B signaling pathway as a potential therapeutic target for DMD.

More informations about IKK/NF-kB:

"Since NF-κB regulation maintains a delicate balance between cell survival and apoptosis and is very important for host defense mechanisms, the specificity and duration of the NF-κB–inhibiting agent becomes highly relevant in designing effective pharmacological therapies against chronic diseases. Whereas IKKβ inhibition in macrophages is beneficial in reducing inflammation in cancer, IKKα loss in macrophages can actually elevate the immune response by increasing the production of proinflammatory cytokines and chemokines, thus underscoring the importance of specificity for IKK inhibitors. Similarly, though administration of nonspecific agents such as MG-132 and, more recently, a synthetic antioxidant ,has been shown to ameliorate the dystrophic phenotype, risks of inhibiting unwanted cellular targets can also sometimes outweigh the benefits. In addition, our inability to detect clear evidence of IκBα degradation in dystrophic muscles may argue against the use of general proteasome inhibitors as a therapeutic strategy for blocking classical NF-κB signaling in DMD. Hence, the implementation of a specific NF-κB inhibitor such as the NBD peptide might provide maximal therapeutic benefit with minimal side effects (. Although long-term inhibition of NF-κB is associated with a vulnerability to bacterial infections and mounting immune responses, it is noteworthy that the NBD peptide has not been found to block basal NF-κB activity and, as seen in this and
previously described studies, does not exhibit overt signs of toxicity. Together, the results identify the IKK/NF-κB signaling
pathway as a viable target for anti-DMD therapy." 

USA - PGC- 1 alfa é um ativador de genes. Este ativador aumenta nos exercícios e aumenta a quantidade de mitocôndrias, um organela responsável pela energia das células. O camundongo com distrofia muscular tem redução da PGC-1 alfa. Camundongos com distrofia muscular e geneticamente modificados para apresentar uma superexpressão da PGC-1 alfa apresentaram redução dos sintomas da doença e aumento da força muscular. Não há uma maneira, até o momento, de ativar a PGC-1 alfa em seres humanos.

 

 

 


 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

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